聯(lián)系電話(huà)
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話(huà)：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門(mén)大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪(fǎng)問(wèn)手機(jī)商鋪
細(xì)胞的復(fù)蘇及凍存方法
一. 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細(xì)胞于 37℃ 水浴,，快速溶化,，用 8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液,，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘,。 棄上清,，再吸取 8.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀,，再 1500 轉(zhuǎn)/ 分,，離心 3 分鐘，棄上清,，細(xì)胞沉淀用 1.0ml 培養(yǎng)基混勻,，備用。 另取一個(gè) 75cm2 方瓶,，加入 14.0ml 培養(yǎng)基質(zhì),，將上述制備的含 腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于 37℃,，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng),。
若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，大約 3－4 天細(xì)胞基質(zhì)會(huì)變黃,，5.0ml 細(xì)胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養(yǎng),，可用 3－4 個(gè)方瓶培養(yǎng)，一個(gè)方瓶中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞可達(dá) 1-1.5×107 個(gè),，根據(jù)試驗(yàn)所需,，可決定傳代的次數(shù),。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生 長(zhǎng)，經(jīng)過(guò) 3-4 天,，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%-95% 單層時(shí)，棄上清,，用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml),，處理腫瘤細(xì)胞大約 3-5 分鐘，用倒置顯微鏡觀(guān)察,，當(dāng) 90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí),，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分下,，離心 3 分鐘,，棄上清，加少許培養(yǎng)基混勻,，可傳代 3 個(gè) 75cm2 方瓶擴(kuò)大培養(yǎng),。
二. 細(xì)胞凍存
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用 1 個(gè) 75cm2 方瓶按上述方法收集，于 1500 轉(zhuǎn)/分離心 3 分鐘,，棄上清,，用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻，分別加入到 2-3 只保種管中,，寫(xiě)上腫瘤細(xì)胞名稱(chēng),、時(shí)間、保種者姓名,，放- 80℃ 保存,，次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存( 注： -80℃ 下可保存細(xì)胞半年至一年，液氮可保存細(xì) 胞 5-10 年,，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間),。以上所有物品均需經(jīng)過(guò)高溫滅菌 ( 121℃，30 分鐘) ,，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過(guò)過(guò)濾(0.22uM)除菌,，所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù)，避免細(xì)菌,、真菌,、病原體、衣原體等污染,。
