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1 冷凍管應(yīng)如何解凍?

取出冷凍管后,， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,， 否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),，必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂,。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),， 是否應(yīng)馬上去除DMSO?

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),， 在解凍之后,， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題,。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活,。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?

不能,。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響,。來自不同物種的血清,， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活,。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼,，請(qǐng)不要再使用,。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度,。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí),， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞,。

7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基?

視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可,。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素,。

9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于–20 °C,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì),。

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí),， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,， 直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,， 重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來,，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

欲回收動(dòng)物細(xì)胞,， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘,， 過高之轉(zhuǎn)速,， 將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何?

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可,。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因,。

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,， 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級(jí)和無菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之DMSO 等級(jí),， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),，其本身即為無菌狀況,， *次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C,，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì),， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO,， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜,。

15 冷凍保存細(xì)胞之方法?

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存,。*-20 °C 不可超過1 小時(shí)，以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微

降低一些,。

16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌,、酵母菌、霉菌,、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng),、操作室環(huán)境不佳,、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù),、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),，應(yīng)如何處理?

直接滅菌后丟棄之,。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

不能,。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，

無法以其外觀分辨之,。

20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù),， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義,。

21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理?

直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細(xì)胞株,。

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,，顏色會(huì)偏暗紅色,， 且pH值會(huì)越來越偏堿性?

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無菌過濾之CO2,， 以調(diào)整pH 值,。

24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同?

不同廠牌的dish 或flask,， 其所coating 的polymer 不同,， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異,。

25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,， 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失,。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤,。冷凍細(xì)胞解凍后,， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,。細(xì)胞置于–80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂,，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落之原因?

冷凍管瓶蓋裂紋,，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),，造成冷凍管裂損,，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊,。

另：這里補(bǔ)充一下培養(yǎng)用品的消毒，供參考：

細(xì)胞培養(yǎng)的zui大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌,，真菌和病毒等微生物的污染,，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔,，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不*,，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī),，防止發(fā)生污染,。

消毒方法分為三類：

(A) 物理滅菌法(紫外線、濕熱,、過渣等);

(B) 化學(xué)滅菌法(各種化學(xué)消毒劑);

(C) 抗生素,。

(1)紫外線消毒：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿,。紫外線直接照射方便,、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后,，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米,，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔,，照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外線可產(chǎn)生臭氧,，污染空氣,，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害,，不宜近照射也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,。

(2)溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀荆且环N使用zui廣泛,、效果的消毒方法,。溫?zé)嵯緯r(shí),，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險(xiǎn),，保證其內(nèi)氣體的流通,。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣,，冷氣空氣排出后,，關(guān)閉排氣閥門，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如,，繼后開始升壓,，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開始記算消毒時(shí)間,。消毒過程中,，操作者不能離開工作崗位，要定時(shí)檢查壓力及安全,，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生,。

常用物品消毒壓力及時(shí)間：

培養(yǎng)液、橡膠制品,、10磅10分鐘;

布類,、玻璃制品、金屬器械,、18磅20分鐘,。

上兩種是zui常見的物理消毒方法。

(3)化學(xué)消毒法：zui常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅,，前者主要用于操作者的皮膚,，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒,?；瘜W(xué)消毒法操作簡單、方便有效,。

(4)抗生素消毒：確切應(yīng)記成抗生素滅菌,，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。

如果已經(jīng)發(fā)生真菌污染,，原則上應(yīng)盡快丟棄,，但是如果是比較珍貴的細(xì)胞系，可以用抗真菌藥物來嘗試搶救,，用一般用量的5～10倍來沖擊治療,，24～28h后換常規(guī)培養(yǎng)液。但是這種方法一般只是在污染早期才有效!

35.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性,。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制胰蛋白酶的活性,。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞,，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子,。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它,。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?

大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次,，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,，將會(huì)影響它的性能。

46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,，如果在室溫下放置超過30分鐘,，就會(huì)變得不穩(wěn)定。

47.保存血清的方法?

我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃,。若存放于4℃時(shí),，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。若一次無法用完一瓶,，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),，再放回冷凍。

48. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

將血清從冷凍箱取出后,，先置于2～8℃冰箱使之融解,，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻,。

49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中,，亦是造成沉淀物的原因之一,。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量,。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi),，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾,。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過濾膜,。

50. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng),。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件,，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺,，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞,、平滑肌細(xì)胞時(shí),，推薦使用熱滅活血清。

51. 有必要做熱滅活嗎?

實(shí)驗(yàn)顯示,，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn),，或*沒有任何作用,，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低,。而經(jīng)過熱處理的血清,，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,，像是“小黑點(diǎn)”,，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中,，又會(huì)使此沉淀物更增多,，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

若非必須,，可以不需要做熱處理這一步,。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量!

52. 為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化,，儲(chǔ)存在2-8℃時(shí),，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原,、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁,。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在-20℃儲(chǔ)存胎牛血清,，避免反復(fù)凍融,。

53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時(shí),，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時(shí),，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

(3)請(qǐng)勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁,，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活,，請(qǐng)遵守56℃,，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻,。溫度過高,，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多,。