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一,、實驗前應(yīng)明確的問題
1. 選擇適當?shù)募毎臃N濃度,。
一般情況下,，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率,、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線,，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿,。這樣,，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低,，太少觀察不到差異,。
2. 藥物濃度的設(shè)定。
一定要多看文獻,，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩,。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記,！否則,，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設(shè)定,。
在不同時間點的測定OD值,，輸入excel表，zui后得到不同時間點的抑制率變化情況,，畫出變化的曲線,，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應(yīng)該就是的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。
4. 培養(yǎng)時間,。
200 ul的培養(yǎng)液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說,，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話,，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的,。
5. MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力,，不能測定細胞數(shù)。
做MTT時,，盡量無菌操作,，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6. 理論未必都是對的,。
要根據(jù)自己的實際情況調(diào)整,。
7. 實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔,，加藥孔,。
調(diào)零孔加培養(yǎng)基,、MTT、二甲基亞砜,。對照孔和加藥孔都要加細胞,、培養(yǎng)液、MTT,、二甲基亞砜,，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物,。
8. 避免血清干擾,。
用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值,。由于試驗本底增加,，會試驗敏感性。因此,，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行,。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液,。
二,、實驗步驟
（一）貼壁細胞
1. 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度,，每孔加入100 ul,，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）,。
2. 5%CO2,，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,，加入濃度梯度的藥物,，原則上，細胞貼壁后即可加藥,，或兩小時,，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板,，次日上午加藥.一般5-7個梯度,，每孔100 ul，設(shè)3-5個復孔.建議設(shè)5個,，否則難以反應(yīng)真實情況,。
3. 5%CO2，37 ℃孵育16-48小時,，倒置顯微鏡下觀察,。
4. 每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml,，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h,。若藥物與MTT能夠反應(yīng),，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后,，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5. 終止培養(yǎng),，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,。
6. 每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min,，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。
7. 同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基,、MTT,、二甲基亞砜），對照孔（細胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液、MTT,、二甲基亞砜）,。
（二）懸浮細胞
1. 收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml,，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ,；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預試尋找*稀釋度,，1：10-1：20）,；③需檢測物10 ul；④細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔）,，共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）,。每板設(shè)對照（加100 ul 1640）。
2. 置37 ℃,，5%CO2孵育16-48小時,，倒置顯微鏡下觀察。
3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,，即0.5%MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1,，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4）,，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值）
4. 離心（1000轉(zhuǎn)x10 min）,，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10 min,，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值,。
5. 同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基,、MTT、二甲基亞砜）,，對照孔（細胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液,、MTT,、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復孔,。
