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原理：
細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù),，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞,。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大,，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng),；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱,，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱,，腫瘤細(xì)胞強(qiáng),。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時(shí),，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液,，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周,，隨時(shí)檢查,，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。
基本步驟：
(1)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,，使之成為單細(xì)胞,，作活細(xì)胞計(jì)數(shù),，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋,。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液,，高壓滅菌后，維持在40℃中不會(huì)凝固,。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固,，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用,。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻,，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中,，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后,，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天,。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù),。計(jì)算形成率,。
軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí),，瓊脂溫度不宜超過40℃,。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞,。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖,，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。
