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標簽： 新生大鼠 心肌細胞 原代培養(yǎng)
新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)可以：（1）細胞保種,；（2）用于細胞形態(tài)研究,；（3）應用于臨床研究,。
實驗方法
- 胰酶消化法
| 實驗方法原理 | 將大鼠的心肌細胞從機體中取出,，經胰酶,、螯合劑（常用EDTA）處理,，分散成單細胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞得以生存、生長和繁殖,。 |
|---|---|
| 實驗材料 | SD 乳鼠 |
| 試劑,、試劑盒 | 低糖 DMEM、胰酶 EDTA 青鏈霉素 碳酸氫鈉液 新生牛血清 谷氨酰胺 D-Hank's 液 新潔爾滅 碘酒 酒精 |
| 儀器,、耗材 | 鋁盒 眼科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎剪 玻璃培養(yǎng)皿 廣口瓶 棉球 燒杯 錐形瓶 離心管 磁力攪拌器 攪拌子 水浴振蕩器 尼龍篩網 針式濾器 |
| 實驗步驟 | 一,、實驗材料準備 1. 動物 出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。
2. 試劑 低糖 DMEM,、胰酶(含 EDTA),、青鏈霉素、碳酸氫鈉液,、新生牛血清,、谷氨酰胺、D-Hank's 液,。0.1%新潔爾滅,、碘酒、75%酒精,，培養(yǎng)液(DMEM,，新生牛血清，青鏈霉素),。
3. 手術器械和儀器 鋁盒,、眼科直剪、眼科彎剪,、眼科直鑷,、眼科彎剪,、玻璃培養(yǎng)皿(共 2 套，一套用于解剖取材,，另一套用于剪碎心臟組織),、100 ml 廣口瓶兩個(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯,、250 ml 錐形瓶,、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器),、150-200 目尼龍篩網和針式濾器,。
二、方法 1. 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度,，并放置于 37℃水浴中溫育好,。
2. 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚,，再用酒精棉球脫碘,。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮,，充分撕拉開,，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨,，然后在切口中間橫剪胸骨,。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來,。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下,，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復以上過程,。取材完畢后,，撤掉取材的手術器械。
3. 用第二套手術器械進行下列操作,。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉,，放在另一個預先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中,，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中(或者其它合適容器中,，視個人習慣),，加少許 0.06%胰酶,，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中,，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶中,，補加胰酶至終體積10 ml，加上塞子,，放在 37℃水浴中(可以用一個消毒的500 ml燒杯,，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量,，水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可,，過少則溫度會不均勻，過高容易污染,。打開磁力攪拌器電源,，預先將水溫調節(jié)到 37℃)，調節(jié)轉速至 60 rpm左右,，消化15 min(務必保證水浴溫度恒定在 37℃,，并且消化時間不超過 15 min)?；蛘?，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子,，直接放在水浴震蕩器中消化亦可,，轉速和消化時間相同。
4. 從水浴中取出錐形瓶,，小心吸去上清,，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。
5. 加入10 ml 新的胰酶,，用一支新的吸管吹打溶液幾次,，機械分散細胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打,，否則會導致組織過度消化,，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數目少(比如 5,、6 只的時候),，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度,。上述消化處理的同時,，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后,，小心移出上清轉至上述加有培養(yǎng)液的離心管中,，*次消化收集的分離出的細胞，*次消化結束后,；繼續(xù)第二次消化,，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。
6. 重復 5 消化步驟,，直至剩余少許組織塊為止,，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數的組織塊(不含棄去消化液的那次)。
7. 第 1,、2 次含細胞的消化液放在一根離心管中,，過 180 目篩網后，一起離心,；第 3,、4 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網后,，一起離心,。zui后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細胞,，接種到一個 75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中,，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時后，取出,，棄貼壁細胞(主要是成纖維細胞和內皮細胞),，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數后,，加入培養(yǎng)液調整細胞濃度為5-6x105個/ml,，接種到目的培養(yǎng)器皿中。
5. 一般不用加BrdU,，如果培養(yǎng)時間長(發(fā)現(xiàn)成纖維細胞也極少),，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU,，心肌細胞搏動的持續(xù)時間會更長,。
9. 接種后 24 小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次,，以去處未貼壁的細胞(部分細胞會在 24 小時后貼,，結果很多細胞重疊生長)，再更換培養(yǎng)液,，即可,?？梢园凑諏嶒炐枰谂囵B(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。
三,、 結果 心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁,，此時細胞伸出偽足,，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,，如多角形,，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好,， DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色,，兩天后變?yōu)榈S色，應該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn),，也說明細胞生長狀況良好,。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的zui簡單的辦法就是搏動與否,，注意：當搏動比較微弱的時候,，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到,。檢驗操作是否合格的的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力,。另外，心肌細胞表達肌動蛋白,，可以作為鑒定,，但不是*的特征性指標，因為平滑肌細胞也表達,。
收起 |
| 其他 | 一,、實驗討論 乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養(yǎng)過程較為繁瑣,。文獻上有多種濃度胰酶消化方法,，0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小，但這個濃度消化所需時間較長,。采取多次反復低濃度消化的方法,，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液,，離心所得即為心肌細胞,。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁 1.5 h,，充分去除成纖維類細胞,，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核,，胞質突起,，生長時呈放射狀，并且會增殖,，不搏動,，很好和心肌細胞鑒別。消化和吹打一定不要過度,，是保證心肌細胞活力zui重要的一個原則,。而接種密度(一般不低于 105/ml)，也將影響到心肌細胞的搏動及同步化搏動,。 |
