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（一）原 理

由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng),。“不連續(xù)系統(tǒng)”zui大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率,。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng),；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同,，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分,、pH也不相同,。在實(shí)驗(yàn)中,，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠,，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl,，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠,，稱為分離膠或電泳膠,，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9,。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸,，pH8.3?？梢?jiàn),，凝膠濃度、成膠成分,、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同,，形成了一個(gè)不連續(xù)系統(tǒng)。

電泳時(shí),，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上,，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴(kuò)散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合,，以提高密度,；為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動(dòng)的情況，樣品中還加入溴酚藍(lán)等示蹤染料,，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動(dòng)的速度都快,，只要染料未泳動(dòng)出凝膠管，樣品就沒(méi)有走出膠管的危險(xiǎn),。

在不連續(xù)系統(tǒng)中,，當(dāng)接通電源開(kāi)始電泳時(shí),，系統(tǒng)中的甘氨酸、蛋白質(zhì),、HCl中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子,，形成離子流向陽(yáng)極泳動(dòng)。其遷移率取決于離子的電荷數(shù),、分子量大小及形狀,。然而，當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時(shí),，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7）,，pH下降了近兩個(gè)單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97）,，于是甘氨酸的解離度突然降低,，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢,。血清樣品中個(gè)蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠,，pH的改變雖對(duì)其解離度有影響，但比對(duì)甘氨酸要小得多,，其遷移率比甘氨酸要大,，而且濃縮膠的膠孔較大對(duì)蛋白質(zhì)分子不會(huì)造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離,，分子量很小,，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質(zhì),、溴酚藍(lán)都快,。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍(lán)

甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降,，造成移動(dòng)離子流的突然缺失,，出現(xiàn)電流減小電導(dǎo)率下降。然而,，整個(gè)電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變,，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度,，I為電流強(qiáng)度,，n為電導(dǎo)率）的關(guān)系，于是在前導(dǎo)離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度,。處在這個(gè)局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分,，在高電場(chǎng)作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導(dǎo)Cl-離子區(qū)域。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl-區(qū)域時(shí)因不缺少離子,，大的電場(chǎng)強(qiáng)度減弱,，離子移動(dòng)速度急速減慢下來(lái)，其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層,。通過(guò)這個(gè)過(guò)程，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍,，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層,。

當(dāng)離子流繼續(xù)向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí),，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力,，遷移率減慢，同時(shí)在pH8.9條件下,，甘氨酸又充分解離,，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象,，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì),。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場(chǎng)強(qiáng)度，蛋白質(zhì)的分離*按一般區(qū)帶點(diǎn)用方式進(jìn)行,。

由以上的原理可見(jiàn),，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳zui主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠,。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開(kāi)且壓縮成層,，可以減少在電泳時(shí)，成分間由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來(lái)的干擾,，這樣就提高了電泳的分辨能力,。由于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好,，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個(gè)區(qū)帶,。

（二）試劑和器材

1．測(cè)試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG,、純化后的IgG,。

2．試劑

（1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑

① 凝膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml,，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g,，TEMED（N，N,，N`,，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調(diào)pH8.9,，然后加重蒸餾水定容至100ml,，置棕色瓶，4℃貯存,。

② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲(chǔ)液：丙烯酰胺（Acr）28.0g,，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml,。過(guò)濾后置棕色試劑瓶中,，4℃ 貯存，一般可放置1個(gè)月左右,。

③ 分析純過(guò)硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml,，置棕色瓶，4℃儲(chǔ)存僅能用一周,，當(dāng)天配制,。上述3種試劑用于制備分離膠。

④ 濃縮膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml,，Tris5.98g,，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7,，用重蒸水定容至100ml,，置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存,。

⑤ 濃縮膠貯液：稱Acr10g,，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶?jī)?nèi),，4℃貯存,。

⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）

⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解,，定容至100ml,，置棕色試劑瓶?jī)?nèi)，4℃貯存,。

（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液

稱Tris6.0g,，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調(diào)pH8.3后,，用重蒸水定容至1000ml,，置試劑瓶中，4℃貯存,，臨用前稀釋10倍,。

（3）0．1%溴酚藍(lán)指示劑

（4）染色液 染色液種類較多,，染色方法也不*相同。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中,，含20%磺基水楊酸,，其優(yōu)點(diǎn)是染色、固定同時(shí)進(jìn)行,，背景易脫色,。0.5%考馬斯亮藍(lán)R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍(lán)0.05g，磺基水楊酸20g,，加蒸餾水至100ml,，過(guò)濾后置試劑瓶?jī)?nèi)保存。

（5）脫色液 7%乙酸溶液

（6）保存液 甘油10ml,，冰乙酸7ml,，加蒸餾水至100ml,。

（7）1%瓊脂（糖）溶液   瓊脂（糖）1g,，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解,，4℃貯存,，備用。

3．器材   電泳儀 夾心式垂直板電泳槽,。

（三）操作方法

1．安裝夾心式垂直板電泳槽

夾心式垂直板電泳槽操作簡(jiǎn)單,，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽,，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模,，該模由一個(gè)上框形凝膠框、長(zhǎng)與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成,。電泳槽由上儲(chǔ)槽（白金電極在上或面對(duì)短玻璃板）,，下儲(chǔ)槽（白金電極在下或面對(duì)長(zhǎng)玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個(gè)電極槽與凝膠模間靠?jī)?chǔ)液槽螺絲固定,。各部間依下列順序組裝：

（1）將上儲(chǔ)槽和固定螺絲銷釘,，仰放在桌面上。

（2）將上,、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中,。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。

（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲(chǔ)槽上,，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上儲(chǔ)槽,。

（4）將下儲(chǔ)槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳蟽?chǔ)槽 ，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽 ,。

（5）豎直電泳槽,，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙,，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡,。

2．配膠

① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml,，分離膠貯液5.0ml,，重蒸餾水2.5ml，充分混勻,，抽氣10min,，zui后加AP 10 ml。

② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合,。

3．制備凝膠板

不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ,，凝膠制備應(yīng)分2步進(jìn)行。

① 分離膠的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,，選擇zui終丙烯酰胺的濃度,，本實(shí)驗(yàn)需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng),?；旌虾蟮哪z溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng),、短玻璃板間的窄縫內(nèi),，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣,，使膠面平整,。為防止?jié)B漏，在上,、下儲(chǔ)槽中加入略低于膠面的蒸餾水,。約30-60min凝膠*聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線,。用濾紙條吸去多余的水,，但不要碰破膠面。如需預(yù)電泳,，則上,、下儲(chǔ)槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液,，10mA電流電泳1h,，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液,，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次,，即可制備濃縮膠,。

② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細(xì)長(zhǎng)的滴管將凝膠溶液加到長(zhǎng),、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方）,，距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板,。在上,、下儲(chǔ)槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣,。在距離電極槽10cm處,，用日光燈或太陽(yáng)照射，進(jìn)行光聚合,，但不要造成大的生溫,。在正常情況下，照射6-7min,，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色,，表明聚合作用開(kāi)始。繼續(xù)光照30min,，使凝膠聚合*,。光聚和完成后放置30-60min,，輕輕取出樣品槽模板,，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液,。使液面沒(méi)過(guò)玻璃板約0.5cm,，即可加樣。

4．加樣

作為分析用的PAGE加樣量?jī)H需幾微克,，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶,。為防止樣品擴(kuò)散，應(yīng)在樣品中加入等體積40%蔗糖（內(nèi)含少許溴酚蘭）,。用微量注射器取5ul上述混合液,，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部,，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品,，即可開(kāi)始電泳。

5．電泳

將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接,，負(fù)極與上槽連接（方向切勿接錯(cuò)）,。接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān),，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10 mA ,。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電流調(diào)至20-30mA,。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時(shí)，將電流調(diào)回到零,，關(guān)電源及冷卻水,。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中,，4℃貯存還可用1-2次,。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框,，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開(kāi)移去,，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色,。

6．固定,，染色

本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時(shí)進(jìn)行,，使染色液沒(méi)過(guò)膠板,，染色30min左右。

7．脫色

用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次,，直至背景藍(lán)色褪去,。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時(shí)間,。脫色液經(jīng)活性碳脫色后,，可反復(fù)使用。

（四）注意事項(xiàng)

1．制備凝膠應(yīng)選用高純度得試劑,，否則會(huì)影響凝膠聚合與電泳效果,。Acr及Bis是制備凝膠得關(guān)鍵試劑，如含有丙烯酸或其它雜質(zhì),，則造成凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng),，聚合不均勻或不聚合，應(yīng)將它們分別純化后方能使用,。Acr及Bis均為神經(jīng)毒劑,，對(duì)皮膚有刺激作用，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)小鼠得半致死量為170mg/kg,，操作應(yīng)在通風(fēng)中進(jìn)行,。Acr的純化：稱70gArc溶于1000ml 50℃預(yù)熱的氯仿中，溶解后趁熱過(guò)濾,。冷卻后,，置-20℃低溫冰箱中，則有白色結(jié)晶析出,，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾,，收集白色結(jié)晶,，再用預(yù)冷的氯仿淋洗幾次，真空干燥后置棕色瓶中密封儲(chǔ)存,。Acr的熔點(diǎn)為84.5+0.3,。純Acr水溶液pH應(yīng)是，其pH值變化不大于0.4pH單位就能使用,。Bis的純化：稱12gBis,，使其溶于1000ml預(yù)熱40-50℃ 的丙酮中，趁熱過(guò)濾,。冷卻后,，置-20℃ 低溫冰箱中，待結(jié)晶析出后,，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾,，收集結(jié)晶，用預(yù)冷丙酮洗滌數(shù)次,，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存,，Bis熔點(diǎn)為185℃。Acr和Bis的儲(chǔ)液在保存過(guò)程中,，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3,，雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4℃儲(chǔ)存能部分防止水解,，但也只能儲(chǔ)存1-2個(gè)月,，可測(cè)pH值（4.9-5.2）來(lái)檢查試劑是否失效。

2．由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條,、玻璃板表面不光滑潔凈,，在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃或硅橡膠條剝離,，產(chǎn)生氣泡或滑膠,；剝交時(shí)凝膠板易斷裂，為防止次現(xiàn)象,，所以器材應(yīng)嚴(yán)格地清洗,。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡抹海綿蘸取“洗潔凈”仔細(xì)清洗,。玻璃板侵泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上,，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復(fù)刷洗,，zui后用蒸餾水沖洗,，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。

3．安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng),、短玻璃的硅橡膠框時(shí),，位置要端正,，均勻用力旋轉(zhuǎn)緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏,。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑,。

4．用瓊脂（糖）封底及灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過(guò),。

5．凝膠*聚合后,，必須放置30min-1h，使其充分“老化”后,，才能輕輕取出樣品槽模板,，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳區(qū)帶扭曲,。

6．為防止電泳后區(qū)帶拖尾,，樣品中鹽離子強(qiáng)度應(yīng)盡量低，含鹽量高的樣品槽可用透析法或凝膠過(guò)濾法脫鹽,。zui大加樣量不得超過(guò)100ug蛋白/100ul,。

7．在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進(jìn)行,，洗凈膠面后才能制備膿縮膠,。濃縮膠制備后， 不能進(jìn)行預(yù)電泳,，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng),。

8．電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正,、負(fù)極不能接錯(cuò),，以免樣品反方向泳動(dòng)，電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流,、電壓,、過(guò)高或過(guò)低均可影響電泳效果。

9．電泳后,，應(yīng)分別收集上下儲(chǔ)槽電極緩沖液,，在冰箱儲(chǔ)存，可用2-3次,。為保證電泳結(jié)果滿意,，用新稀釋的緩沖液。