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水化上樣（ 被動上樣）
1. 從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min,。
2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣,，中間的樣品液一定要連貫,。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質(zhì)的分布,。
3. 用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護層,。注意：堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作,。
4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上,。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面，因為這些溶液不會被膠條吸收,； 還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡,。如產(chǎn) 生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端,，上下移動膠條,，直到氣泡被趕走。
5. 放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收,，沿著膠條緩慢加入礦物油,，每根膠條 約 3ml（17cmIPG），防止膠條水化過程中液體蒸發(fā),。
6. 置等電聚焦儀于- 20℃水化 11~15h,。
*向 等電聚焦
1. 將紙電極置于聚焦盤的正負極上，加 ddH2O 5~8μl 潤濕,。
2. 取出水化好的膠條,，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下,，將其置于剛好潤濕 的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物,。
3. 將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中，膠條的正極（標有+）對應(yīng)于聚焦盤的正 極,，確保膠條與電極緊密接觸,。
4. 在每根膠條上覆蓋 2- 3ml 礦物油。
5. 對好正,、負極,，蓋上蓋子,。設(shè)置等電聚焦程序。
6. 聚焦結(jié)束的膠條,，立即進行平衡,、第二向 SDS-PAGE電泳?；?qū)⒛z條置于樣 品水化盤中,，- 20℃冰箱保存，電泳前取出膠條,， 室溫放置10 分鐘,，使其溶解。
第二向 SDS-PAGE電泳
1. 配制 12%的丙烯酰胺凝膠,。
2. 待凝膠凝固后,， 倒去分離膠表面的MilliQ水、 乙醇或水飽和正丁醇,，用MilliQ 水沖洗,。
3. 配制膠條平衡緩沖液 I
4. 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上,。將另 一份厚濾紙用 MilliQ水浸濕，擠去多余水分,，然后直接置于膠條上,，輕輕吸 干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋,。
5. 將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中,，加入 6ml（17cmIPG）平衡緩沖液 I ，在水平搖床 上緩慢搖晃 15 分鐘,。
6. 配制膠條平衡緩沖液 II ,。
7. *次平衡結(jié)束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體,，放入平衡緩 沖液 II 中,，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。
8. 用濾紙吸去 SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體,，將二向凝膠放在桌面上,， 凝膠的頂部面對自己。
9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解,。
10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液,。
11. 第二次平衡結(jié)束后，取出膠條,，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙 上,，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） ,。
12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次。
13. 將膠條背面朝向玻璃板,，輕輕放在長玻板上,，加入低熔點瓊脂糖封膠液。
14. 用適當厚度的膠片,，輕輕地將膠條向下推,，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接 觸。注意：不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡,， 應(yīng)推動凝膠背面的支撐膜,， 不要碰到面膠。
15. 放置 5 分鐘,，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固,。
16. 打開二向電泳制冷儀，調(diào)溫度為 15℃,。
17. 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中,，加入電泳緩沖液，接通電源,，起始時用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm） ,，待樣品在*走出IPG 膠條，濃縮成一條線后,，再加大電流 （20-30mA/gel/17cm） 待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳,。
18. 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃,，取出凝膠,，并切角以作記號（戴手套，防 止污染膠面） ,。
19. 進行染色,。
