聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
水化上樣（ 被動(dòng)上樣）
1. 從冰箱中取出 IPG 膠條,，室溫放置 10min。
2. 沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品,，槽兩端各 1cm 左右不加樣,，中間的樣品液一定要連貫,。注意：不要產(chǎn)生氣泡,，否則會(huì)影響膠條中蛋白質(zhì)的分布,。
3. 用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護(hù)層,。注意：堿性端較脆弱,，應(yīng)小心操作,。
4. 將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面,，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收,； 還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn) 生了氣泡,，用鑷子輕輕地提起膠條的一端,，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕走,。
5. 放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收,，沿著膠條緩慢加入礦物油，每根膠條 約 3ml（17cmIPG）,，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā),。
6. 置等電聚焦儀于- 20℃水化 11~15h。
*向 等電聚焦
1. 將紙電極置于聚焦盤的正負(fù)極上,，加 ddH2O 5~8μl 潤(rùn)濕,。
2. 取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干,，膠面朝下,，將其置于剛好潤(rùn)濕 的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。
3. 將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中,，膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正 極,，確保膠條與電極緊密接觸。
4. 在每根膠條上覆蓋 2- 3ml 礦物油,。
5. 對(duì)好正,、負(fù)極，蓋上蓋子,。設(shè)置等電聚焦程序,。
6. 聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡,、第二向 SDS-PAGE電泳,。或?qū)⒛z條置于樣 品水化盤中,，- 20℃冰箱保存,，電泳前取出膠條， 室溫放置10 分鐘，使其溶解,。
第二向 SDS-PAGE電泳
1. 配制 12%的丙烯酰胺凝膠,。
2. 待凝膠凝固后,， 倒去分離膠表面的MilliQ水,、 乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ 水沖洗,。
3. 配制膠條平衡緩沖液 I
4. 在桌上先放置干的厚濾紙,，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另 一份厚濾紙用 MilliQ水浸濕,，擠去多余水分,，然后直接置于膠條上，輕輕吸 干膠條上的礦物油及多余樣品,，這樣可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋,。
5. 將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中，加入 6ml（17cmIPG）平衡緩沖液 I ,，在水平搖床 上緩慢搖晃 15 分鐘,。
6. 配制膠條平衡緩沖液 II 。
7. *次平衡結(jié)束后,，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體,，放入平衡緩 沖液 II 中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘,。
8. 用濾紙吸去 SDS-PAGE膠上方玻璃板間多余的液體,，將二向凝膠放在桌面上， 凝膠的頂部面對(duì)自己,。
9. 將瓊脂糖封膠液加熱溶解,。
10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。
11. 第二次平衡結(jié)束后,，取出膠條,，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙 上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） ,。
12. 用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次,。
13. 將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長(zhǎng)玻板上,，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液,。
14. 用適當(dāng)厚度的膠片，輕輕地將膠條向下推,，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接 觸,。注意：不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡， 應(yīng)推動(dòng)凝膠背面的支撐膜， 不要碰到面膠,。
15. 放置 5 分鐘,，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液凝固。
16. 打開二向電泳制冷儀,，調(diào)溫度為 15℃,。
17. 將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液,，接通電源,，起始時(shí)用的低電流（5mA~10mA/gel/17cm） ，待樣品在*走出IPG 膠條,，濃縮成一條線后,，再加大電流 （20-30mA/gel/17cm） 待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。
18. 電泳結(jié)束后,，輕輕撬開兩層玻璃,，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套,，防 止污染膠面） ,。
19. 進(jìn)行染色。
