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一,、原理

AFLP也是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長度檢測DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù),。但AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增,，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測出來,。實驗中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接,，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點,。實驗中，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個選擇性核苷的不同引物,，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的,。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內(nèi)切酶片段，進(jìn)行結(jié)合,，導(dǎo)致特異性擴(kuò)增,。

二、實驗試劑

Taq酶,、EcoRI/ MseIEcoRI/MseI接頭,、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物,、瓊脂,、過硫酸胺、丙烯酰胺,、尿素,、硝酸銀、甲酰胺,、 dNTPs,、 二甲苯青、冰醋酸,、玻璃硅烷,、50bpMark

三、操作步驟

（一） 基因組DNA提取和純化

A ,、參考實驗一的大量提取DNA實驗方法,，

B、DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小,，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化,，首先用TE緩沖液補滿至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）,、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次,，離心吸上清液于Eppendorf管中,，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無水乙醇，－20℃放置2h以上,，10000g離心10min,，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風(fēng)干后溶于30μlTE緩沖液中,，UV-2401PC（島津）紫外分光光度計檢測A260,、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小,。

注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶,，0.5g組織，溶液E可增加至300ul,，此時DNA濃度大約為100ng/ul,。

（二）限制性酶切及連接

在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩沖液,， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液,，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ,，2U T4連接酶,，50pmol MseⅠ接頭（序列見表2），雙蒸水補至25μl,。用PE公司PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃反應(yīng)后,，于65℃20min滅酶活，－20℃保存,，作為預(yù)擴(kuò)增模板,。

（三）預(yù)擴(kuò)增

取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A,，75ng M+C引物,，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs,，1UTag酶,，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30μl,。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s,；94℃30s，56℃1min,，72℃1min,，30循環(huán)；72℃10min（PE公司PCR儀）,。反應(yīng)結(jié)束后,，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0。5μg/ml）電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖①）,，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍,，用作選擇性擴(kuò)增模板。

（四）選擇性PCR擴(kuò)增

取釋稀后的產(chǎn)物3μl,，加入EcoRⅠ選擇性引物,、MseⅠ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+,，25mmol/LdNTPs,，1UTag酶，3μl10×PCR緩沖液,，加雙蒸水補至30μl,。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s,，65℃1min,，72℃1min，13循環(huán)（每循環(huán)降0,。7℃）,；94℃30s， 56℃1min,，72℃1min,，25循環(huán)；72℃5min（PE公司PCR儀）,，先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物,。

（五）凝膠電泳

擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離（BIO-RAD公司測序電泳儀）。拔出梳子,，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘,，溫度達(dá)到47～49℃。務(wù)必使每個孔清洗出尿素,。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺,，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青,，0.25%溴酚藍(lán)）94℃變性5min（PE公司PCR儀）,，結(jié)束后迅速置于冰上直到點樣。每個泳道加樣8μl,。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘,，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳,，溫度保持在43℃左右,，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處,，結(jié)束電泳。

（六）銀染

固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中,。染色液：1g AgNO3 ,，1.5ml 37%甲醛，加去離子水至1L,。顯色液：30g Na2CO3,，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉,，加去離子水至1L,。

① 電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中,。

② 固定：加入固定液,，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后,，固定液保留,。

③ 加入去離子水漂洗3次，每次2min,。

④ 染色：將凝膠放入染色盤中,，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震蕩30min,。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后,，置入顯色盤中。

⑤ 顯色：加入顯色液（4℃）,，在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止,。

⑥ 終止：加入b步驟用后的固定液，來回漂幾分鐘,。達(dá)到效果后,，用蒸餾水漂洗幾分鐘。

⑦ 去除凝膠和玻璃板上的水珠后,，放在白光燈箱上用Nikon數(shù)碼相機(jī)拍照,。

（七）數(shù)據(jù)分析