聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線，28℃培養(yǎng),。
1.1.2. 挑取單菌落接種于5ml YM液體培養(yǎng)基中，220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)12-16 hr,。
1.1.3. 取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml YM液體培養(yǎng)基中,，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5,。
1.1.4. 轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液,。
1.1.5. 加入10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液,，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min,。4℃5000rpm離心5min,，去上清。
1.1.6. 加入4ml預(yù)冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,，輕輕懸浮,。
1.1.7. 農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存于-70℃,。
1.2. 雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
取1μg左右的質(zhì)粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細(xì)胞中,，混勻后，冰浴30min,，-70℃放置10min ,。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接著冰浴2min,，加入800mlYM液體培養(yǎng)基28℃,，175rpm搖培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上,。28℃培養(yǎng)到形成單菌落。
其中 YM 可以用LB 代替 ,，*次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代,。
