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專題：細胞轉染操作方法

2013-7-8　　閱讀(1538)

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轉染 ,，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術,。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉染大致可分為物理介導,、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法,、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例,；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質體轉染方法,、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法,，有較為原始的原生質體轉染,，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

理想細胞轉染方法,，應該具有轉染效率高,、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術,，是目前轉染效率zui高的方法,，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,，病毒轉染方法的準備程序復雜,，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及,。其它物理和化學介導的轉染方法,，則各有其特點。

需要指出的一點,，無論采用哪種轉染技術,，要獲得*的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化,。影響轉染效率的因素很多,，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài),，到轉染方法的操作細節(jié),，都需要考慮。

一,、細胞傳代

1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌）,，酒精棉球，廢液缸,，試管架,，微量移液器,，記號筆，培養(yǎng)皿,，離心管,。

2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次,。

3. 用Tip頭加入1ml Trypsin液,，消化1分鐘（37℃，5%CO2 ）,。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。

4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應,。

5. 用Tip頭多次吹吸,，使細胞*分散開。

6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中,，1000rpm離心5min,。

7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿,。

8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布,。

9. 將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉染。

二,、細胞轉染

1. 轉染試劑的準備

① 將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物,。

② 震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。

2. 選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩,。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。

5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。

6. 到時后,，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時。

三,、第二次細胞傳代

1. 在轉染后24小時,，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2. 再次進行細胞傳代,，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉入培養(yǎng)皿中,。

3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。

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