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微生物 水體中大腸菌群的檢測

2013-5-26　　閱讀(1835)

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實驗原理

所謂大腸菌群，是指在37℃培養(yǎng)24h 內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革藍(lán)氏陰性無芽孢桿菌的總稱,。主要由腸桿菌科中四個屬內(nèi)的細(xì)菌組成,，即埃希氏桿菌屬,、檸檬酸桿菌屬,、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬,。

水的大腸菌群數(shù)是指100 mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群zui近似數(shù)（MPN）表示,。在正常情況下,，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細(xì)菌,。這些細(xì)菌都可以隨人畜排泄物進(jìn)入水源,，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量多，所以,，水源中大腸菌群的數(shù)量,，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標(biāo)。目前,，上已*大腸菌群是糞便污染的指標(biāo),。因而對飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。

水中大腸菌群的檢測方法,，常用多管發(fā)酵法和濾膜法,。多管發(fā)酵法可適用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣,，需要的時間較長,。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單,、快速,，但不適用于雜質(zhì)較多、易于堵塞濾孔的水樣,。

材料與器皿

（—）培養(yǎng)基

1,、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

蛋白胨 10g，牛肉膏 3g,，乳糖5g,，氯化鈉 5g，1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL,，蒸餾水 1000mL,，pH 7.2~7.4。

將蛋白胨,、牛肉膏,、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中,，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4,，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL,，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中,，每管10mL，115℃滅菌20min,。

2,、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中,，每管5mL,。

1、 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供平板分離用）

蛋白胨 10g,， 乳糖 10g,，K2HPO4 3.5g，瓊脂 15～20g,，蒸餾水1000mL,，無水亞硫酸鈉 5g，5％的堿性品紅乙醇溶液 20mL,，pH 7.2~7.4,。

4、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用,，3和4可任選一種）

蛋白胨10g,，乳糖10g，K2HPO4 2.0g,，瓊脂20g,，蒸餾水1000mL，2％伊紅（曙紅）水溶液 20mL,，5％美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液13mL,，pH 7.2~7.4。

（二）滅菌移液管,、滅菌稀釋水,、試管、杜漢氏小管,、革蘭氏染色液,、滅菌培養(yǎng)皿。

實驗過程

（一）水樣的采集

供細(xì)菌學(xué)檢驗的水樣,，必須按一般無菌操作的基本要求采集,，并保證再運送、貯存過程中不受污染,。水樣從采集到檢驗不應(yīng)超過4h ,，在0～4℃下保存不應(yīng)超過24h ,，如不能在4h 內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗報告上注明保存時間和條件,。

1,、自來水取樣：應(yīng)在水打開放水5min ，再用無菌容器接取水樣,，待分析,。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL,。

2,、江、河,、湖,、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌,。采樣后,，瓶內(nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗項目聯(lián)合取樣,，細(xì)菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前,。

（二）初發(fā)酵試驗

1、水樣稀釋：制備水樣10-1,、10-2的稀釋液,，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻,，并使其中的細(xì)菌盡量呈單個存在,，即為10-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液,。以此類推,，稀釋到所需倍數(shù)。

2,、接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基（接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡）中各加入水樣10mL,，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL,， 小心混勻放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ,。此即5管法。

3,、結(jié)果觀察：37℃中培養(yǎng)24h后取出觀察,，觀察有無氣體（杜漢氏小管內(nèi)有無氣體）和酸產(chǎn)生（培養(yǎng)基有無變色）。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累,，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色,，便可初步斷定為陽性反應(yīng)。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應(yīng),，說明濃水樣污染嚴(yán)重,，可將樣品進(jìn)一步稀釋后，再按上述方法接種,、培養(yǎng)和觀察,。

（三）平板培養(yǎng)試驗

將初發(fā)酵實驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板上,，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項：

（1）劃線間距至少相隔0.5厘米,；

（2）接種釘要稍彎,；

（3）先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣,；

（4）劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面．以免刮傷或戳破培養(yǎng)基,。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37℃培養(yǎng)18～24h,。

24h后,，觀察在平板上出現(xiàn)的單個菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落,。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落,，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37℃培養(yǎng)24h,。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片,，進(jìn)行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌,，即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在．

（四）復(fù)發(fā)酵驗證實驗

經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落,，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37℃培養(yǎng)24h,，陽性反應(yīng)者即確認(rèn)為大腸菌群細(xì)菌,。

結(jié)果計算

在初發(fā)酵試驗中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細(xì)菌混在陽性可疑反應(yīng)管中,，通過對初發(fā)酵中的陽性可疑管進(jìn)行平板和復(fù)發(fā)酵試驗,，并進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細(xì)菌（“假陽性管”）刪除去,，故在記錄時只能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應(yīng)管,。

如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL,、0.1mL,，可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)（MPN）,。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經(jīng)下面的換算式計算,。

目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值,，即為MPN×10。
 

水樣的總大腸菌群檢索表

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

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