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感受態(tài)細(xì)胞的制備】 感受態(tài)細(xì)胞的制備及溶液配制

2013-5-15　　閱讀(1597)

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1. 挑取適當(dāng)菌株的 E.coli 單菌落接種于 2mlSOB 培養(yǎng)液中,，37℃搖床過夜。

2. 取 0.5-1ml 過夜培養(yǎng)的菌液 轉(zhuǎn)種到 50ml SOB 中,，18℃劇烈震蕩,，直到 A600達(dá)到 0.6,。

3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中,，4℃ 4,000rpm/min離心 10min,。同時(shí)在冰浴 上配置 TB 溶液。

4. 棄上清,，將離心管倒置于濾紙上,，使培養(yǎng)液被吸干。

5. 取 1ml 剛配的 TB 溶液打散菌體沉淀,，再加入 15mlTB（1/3 體積的起始培養(yǎng) 液） ,，冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心 10min,。

6. 棄上清,，沉淀重懸于 4mlTB（1/12.5 體積的起始培養(yǎng)液） ,，冰浴10min。

7. 加入 280μl DMSO,，緩緩滴入并輕輕搖晃,，使其充分混合均勻，冰浴 10min,。

8. 將菌液分裝于 EP 管中，- 80℃或液氮凍存,。

9. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞分別加入 1μl 無菌 ddH2O（陰性對(duì)照）和 1μl 純質(zhì)粒（陽性 對(duì)照）進(jìn)行轉(zhuǎn)化（見后） ,，以檢測(cè)感受態(tài)的質(zhì)量陰。性對(duì)照平板上應(yīng)該無菌落 生長(zhǎng),，陽性對(duì)照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低,。

蛋白胨  20g
酵母提取物  5g
NaCl  0.58g
KCl   0.186g
100×Mg++溶液  10ml
溶解并加水定容至 1L，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌

 

MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至 100ml,，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌

 

1M KCl  5ml
0.55MMnCl2 2ml 
0.5M CaCl2 0.6ml 
0.1MK-Pipes（pH 6.7） 2ml 
ddH2O 10.4ml 
Total   20ml  
注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理

 

0.1M K -Pipes（pH=6.7）的配制：

稱取 3.02g Pipes粉末溶于 80mldd H2O 中,，此時(shí)粉末不能*溶解，用 10N KOH 或 KOH 固體調(diào)節(jié) PH 值,，只有當(dāng) PH 接近 6.7 時(shí)粉末才能*溶解,，此時(shí) 當(dāng)小心少量地加入 KOH 直至達(dá)到所需 PH 值。

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