一,、試劑配制 1. SP 鹽
0.2%（ NH4 ）2SO4，1.4% K2HPO4,，0.6% KH2PO4,， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉,。
2. CAYE （100×）
2 % Casamino acid,，10%酵母膏。
3. SPI 培養(yǎng)基
SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液,，1 %體積100×CAYE 溶液,。
4. SPII 培養(yǎng)基
SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液,。
5. SP-A Salts Solution（500 ml）
（1）0.4% （NH4）2SO4 ：2 g
（2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g
（3）1.2% KH2PO4 ：6 g
（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g
（5）121°C滅菌20 min,。
6. SP-B Salts Solution（500 ml）
（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g
（2）121°C滅菌20 min。
7. 100×CAYE Solution（100 ml）
（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g
（3）121°C滅菌20 min,。
8. SPI Medium（20 mL）
SP-A Salts Solution：9.8 mL
SP-B Salts Solution：9.8 mL
（1%V）Glucose（50%w/v,，115°C滅菌20 min） ：200 μL
（1%V）100×CAYE：200 μL
10. SPII Medium（6 mL）
SPI Medium：5.88mL
（1%V）50mM CaCl2 ：60μL
（1%V）250mM MgCl2：60μL
11. 100×EGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解時需加少量NaOH 至pH8.0,。
二,、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板,，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,。
2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C,，250 r/min 培養(yǎng)過夜,。
3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C,，250 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長末期（168 約4-5 h）,。
4. 取0.2 ml 生長至對數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C,，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘,。
5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C,，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘,。
6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA（DNA 量不能過高,，不超過5 μg）,，再于37 °C,，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板,。
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