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蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

閱讀:3681      發(fā)布時間:2013-9-17
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分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量,。 這種方法是在280nm波長,,直接測試蛋白。

具體使用:

選擇Warburg 公式,,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,,先測試空白液,,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),,一般要消除320nm 的“背景”信息,,設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,,要求A280的吸光值至少大于0.1A,,*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,,發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上,,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度,,乘以一定的系數(shù),,只要吸光值有少許改變,,濃度就會被放大,,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

可能存在的誤差:

蛋白質(zhì)直接定量方法,,適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,,速度快,,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,,如DNA的干擾,;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高,,都可能出現(xiàn)一定的誤差,。

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