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蛋白質(zhì)定量（比色法）

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

常用的比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry 等幾種方法,。

Lowry 法：

以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret相比，Lowry 法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA,，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：

這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物,，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：

這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好,，是Lowry 和BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍,；操作更簡(jiǎn)單，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定１小時(shí)，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry,，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容,。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性,。

某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法,？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性,。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白,，結(jié)果Lowry，BCA 測(cè)出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著,。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,，測(cè)試后的濃度也不一致,。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml。因此,，在選擇比色法之前,，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色皿的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試,。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低,。

可能存在的誤差：

反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外,，非常重要的是,，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色皿,，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。