利用分光光度計(jì)進(jìn)行核酸的定量的原理
分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過(guò)系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收,，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前,，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了zui大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低,，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）,。zui后是操作因素，如混合要充分,，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡,，空白液無(wú)懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色皿測(cè)試空白液和樣品,，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色皿,；樣品的體積必須達(dá)到比色皿要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值,，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,，多肽,，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品，A320一般是0,。
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