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IMR-90細胞株 （細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染,、支原體污染,、原蟲污染、黑膠蟲污染,、真菌污染,、病毒污染以及非細胞污染，那么他們污染細胞的特點分別是什么呢,？怎樣能夠減少污染現象的發(fā)生,？）

1-細菌

細菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等,。細菌污染較易發(fā)現,，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養(yǎng)液一般會在短時間內變黃,，有時靜置的培養(yǎng)液不混,，稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在,，細胞停止生長并有中毒表現。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應的抗生素,，能夠預防絕大多數的細菌污染,。

2-真菌

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其梅雨季節(jié)快要到了,，進行細胞培養(yǎng)時更易污染,。污染細胞的多為煙曲霉、黑曲霉,、毛霉菌,、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等,。霉菌污染后多數在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物,。一般肉眼可見,，較易被發(fā)現,，短期內培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀,、管狀,、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中,。

很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠,；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長,。鏡下看時,，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆,。

真菌污染后,，細胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡,。真菌生長的比較慢,，不象細菌那么容易被發(fā)現，但是一旦發(fā)現有它的存在細胞就被污染了,，也很難救活了,。

3-支原體

支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一種獨立生活的微生物,。對熱敏感,，對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,，多吸附在細胞表面和細胞之間,。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒,，橫斷面與細胞微絨毛相似,。

因國內的血清大多數都沒有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一,。支原體污染細胞后,，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細胞變化不顯著，隨著細胞的培養(yǎng)會慢慢死亡,。

支原體污染檢測（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合,，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察,。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點,。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預防比解決好,。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時,，再換入常規(guī)培養(yǎng)液,，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ,，卡那霉素50μg/ml ,。

2）加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細胞熱處理除菌,。因高溫對細胞本身也會產生一定影響,，故熱處理前需先進行預實驗，確定對細胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時間,。

4-黑膠蟲

黑膠蟲的存在目前尚有爭議,，其在低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,，培養(yǎng)液也是不渾的,，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失,，除更換血清外無須特殊處理,。

5-原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多,，輕微活動,，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好,，邊緣不清楚,，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng),。這種共生是非常普遍的,，但他們的數量小，細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長,，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長,，zui終形成惡性循環(huán)。

6-病毒

組織細胞培養(yǎng)過程中,，如果沒有除去潛在的病毒,，就會產生病毒污染。目前,，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現不少于20種血清性病毒,。 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產疫苗是不安全的。因此,，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗,、干擾素等生物制品制作中的難題。

7-非同種細胞污染

即細胞交叉污染,，由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前,，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,，致使許多實驗宣告無效,。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生,，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學物質所致。

污染是細胞培養(yǎng)的大敵,，預防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關鍵之一,。危機意識要貫徹實驗的始終，否則不僅浪費時間,，而且浪費人力,、物力，甚至造成無法彌補的損失,。

（如何預防細胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢,？）慧穎 細胞庫 技術為您解答：

一、污染的預防

預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法,。只有預防工作做在前,，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責任心要強,，要細心穩(wěn)重,，操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,，按規(guī)定穿隔離衣,。進入后關好門，坐下來盡量少走動,。工作開始要先用75%酒精棉球擦手,、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材,、溶液和培養(yǎng)物,，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用,，以免造成大批污染,。

2、操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內打開瓶口,，并將瓶口轉動燒灼,。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面,。

3,、操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底,。一旦發(fā)現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去,。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊,，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面,。

2-從物品、用品消毒滅菌著手

細胞培養(yǎng)所用物品清洗,、消毒要*,，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用,。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌,。

3-防止細胞交叉污染

在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分,，做上標記便于辨別,。并按順序進行操作，避免一起進行時易發(fā)生混亂,。

在進行換液或傳代操作時,，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞,。

所有細胞一旦購置,，或從別處引入，或自己建立,，均應及早留種凍存,，一旦發(fā)生污染可棄之復蘇，重新培養(yǎng),。

二,、污染的清除

培養(yǎng)細胞一經污染，多數較難處理,。如果污染細胞價值不大,，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的,，可在尋找原因后*消毒操作室,，復蘇或重新購置細胞,，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大,，又難于重新得到,，可采取以下辦法清除。

1-使用抗生素

抗生素對殺滅細菌較有效,。聯合用藥比單獨用藥效果好,。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL）,，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法,，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液,。此法在污染早期可能有效,。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,，還可用慶大霉素,、卡那霉素、多粘菌素,、四環(huán)素、制霉菌素等,。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理,，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進行治療,。近年來有報道,，4-氟，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）,、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效,。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用濃度Cip為10μg/mL,，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL,。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液,，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液,，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個輪次,，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次,。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長,，故經抗血清處理后11天即轉為陰性,，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,，不如用抗生素方便,、經濟。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,，可殺死支原體,，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗,，摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間,。此法有時不可靠。若先用藥物處理后,，再以41℃加溫處理效果更佳,。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外，還有動物體內接種除菌法,、巨噬細胞吞噬法,、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩,，且效果不確定,。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值,，一般均棄之重新培養(yǎng),。

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