HS-1細胞 HS-1細胞 HS-1形態(tài),；中文名稱：皮膚癌細胞系，人,?；鄯f提供HS-1細胞價格，形態(tài),，來源,，STR鑒定，細胞特征特性,，培養(yǎng)條件,，操作注意事項，訂購流程,，售后說明等,。慧穎生物注重產(chǎn)品品質(zhì),，提供zui的產(chǎn)品和售后,，自公司成立以來，獲得了同行業(yè)的*,。六月,，是繁忙的，六月是收獲的季節(jié),，沉甸甸的麥穗,，已經(jīng)顆粒歸倉。六月我們一起前行,，成就人生,，慧穎祝您萬事如意,，心想事成。

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封閉

在轉(zhuǎn)膜之后,，也就是抗體孵育之前，需要對膜進行封閉,。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合,。常用的封閉液有BSA，脫脂奶粉,，血清等,，一般用的是脫脂奶粉,。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用,；不能用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測,；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術(shù),，一種抗體一個脾氣,。

對WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。 無論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù),，和低效之間往往只有數(shù)倍的差異,， 而抗體的效價可以差數(shù)千倍以上；同樣,，正確使用抗體可以保證抗體效價 不被過分的拮抗,，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結(jié)合的蛋白,，包括單克隆抗體和多克隆抗體,；二抗：第二抗體能和一抗結(jié)合，即抗體的抗體,，其主要作用是檢測抗體的存在,，放大一抗的信號。一般二抗都會偶聯(lián)可以檢測的標記（如熒光,、放射性,、化學發(fā)光或顯色基團），用來檢測一抗,；如果一抗本身偶聯(lián)有這些標記,，則不需要二抗，就是所謂的直接WB,。

那么如何正確的來選擇二抗呢？*根據(jù)一抗的種屬來源選擇二抗,；第二根據(jù)一抗的類型選擇二抗,，根據(jù)單體數(shù)量和重鏈分類，將抗體分為IgA,，IgD,，IgE，IgG,，IgM五類,。其中又可分為幾個亞型：IgA1-2，IgG1a,，2a,，2b,，3，IgM1-2,。

顯色

酶促反應可以搭配不同的底物從而實現(xiàn)不同的顯色方法：化學發(fā)光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen,，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發(fā)研制靈敏度更高的發(fā)光底物，化學發(fā)光法的靈敏度已經(jīng)達到pg別,，甚至還有 Femto級別的,，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低,。zui為大家熟悉當數(shù)辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase,，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）,、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase ,。

常見問題分析：

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分：延長封閉時間，更換合適的封閉劑,；一抗?jié)舛冗^高：增加一抗稀釋倍數(shù),；抗體孵育溫度過高：4℃孵育；二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應：設(shè)置二抗對照（不加一抗）,，降低二抗?jié)舛取?/span>

洗膜不充分：增加洗膜次數(shù)

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗,、二抗不匹配：訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物,，可通過設(shè)置內(nèi)參驗證二級系統(tǒng)的有效性,； 更換更好的抗體；一抗,，二抗?jié)舛鹊停涸黾涌贵w濃度,，延長孵育時間封閉劑與一抗有交叉反應：封閉時使用溫和的去污劑，更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少,，設(shè)置陽性對照,，如果陽性對照有結(jié)果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低,，后者可增加樣本上樣量,；轉(zhuǎn)膜不充分還洗膜過度：使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透,，正確的轉(zhuǎn)膜操作,，勿過度洗膜；曝光時間過短：延長曝光時間,，更換更靈敏的發(fā)光液

3.背景有白色/黑色斑

轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡,，抗體孵育時保持搖動；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

HS-1細胞 HS-1細胞 HS-1形態(tài) 運輸：凍存的細胞干冰運輸,，復蘇的細胞冰袋運輸,。冬季我們會選擇全血清包被細胞運輸,，運輸途中細胞處于休眠狀態(tài)，避免天氣過冷導致的細胞死亡,。

HS-1細胞 HS-1細胞 HS-1形態(tài) 在運輸,、轉(zhuǎn)移過程中，請勿打開自封袋,；拿放細胞時請持瓶體,，切勿在非無菌環(huán)境中碰觸、擰動瓶口封口膜位置

進入生物安全柜前,，打開自封袋拿出培養(yǎng)瓶,，噴上酒精放進操作臺(不建議使用酒精棉球擦拭)，撕開封口膜后,，用酒精燈外焰對瓶口燒灼一圈(3秒左右)

細胞凍存如下：

1．細胞：選對數(shù)生長期細胞,，收集細胞24小時前換液一次。

2．計數(shù)：按常規(guī)方法把細胞制成細胞懸液,，計數(shù),，令細胞密度達5×106/ml，離心去上清,，吸入離心管中,。

3．凍存液：先用培養(yǎng)液9分＋DMSO 1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液，按上法一滴滴加入離心管中,，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸,。

4．分裝：分裝入無菌安剖中，每安剖加1.5毫升細胞懸液,。

5．封口：用塑料安剖時擰緊瓶口即可,；如用火焰封閉安剖口后，仔細檢查,，定要封嚴,，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見,，把安剖縫入紗布小袋中,，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人,；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌,，注明：細胞名稱,，凍存日期，以便日后查找,。

豎立培養(yǎng)瓶,，擰開瓶蓋(如是貼壁細胞,，請用真空泵或吸管移除原配培養(yǎng)基，切勿讓瓶口處的液體回流進瓶內(nèi))

更換為含10%-20%血清的*培養(yǎng)基,，嚴格按照無菌操作要求繼續(xù)培養(yǎng),。