細胞凋亡檢測方法

　　 細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式，根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學,、生物化學和分子生物學上的差別,，可以將二者區(qū)別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多,，下面介紹幾種常用的測定方法,。

一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測

　　根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法,。
　　 1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
　　 （1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小,、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，細胞凋亡晚期可見凋亡小體,。
貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓,、脫落,。
　　 （2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等,。凋亡細胞的染色質濃縮,、邊緣化，核膜裂解,、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài),。
　　 2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
　　 一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。
　　 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI,。三種染料與　DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū),。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光,。
　　 Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml,。
　　 DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色,。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
　　 結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,，部分染色質出現(xiàn)濃縮狀態(tài),；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化,；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,，產生凋亡小體(圖1)。

3 透射電子顯微鏡觀察
　　 結果評判：凋亡細胞體積變小,，細胞質濃縮,。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結構(圖2),；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚,、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊,，產生凋亡小體,。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側,，但在細胞凋亡的早期,，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3),。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,，能與PS高親和力特異性結合,。將Annexin-V進行熒光素（FITC,、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針,，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生,。
　　 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜,，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來,。

方法
　　 1 懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul,，室溫避光30min,，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min后,，加入400ul Binding Buffer,，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照,。
　　 2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化,，洗滌、染色和分析同懸浮細胞,。
　　 3 爬片細胞染色：同上,，zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。

　注意事項
　　 1. 整個操作動作要盡量輕柔,，勿用力吹打細胞,。
　　 2. 操作時注意避光，反應完畢后盡快在一小時內檢測,。

三,、線粒體膜勢能的檢測

　　線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降,，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中zui早發(fā)生的事件,，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前,，一旦線粒體DYmt崩潰,，則細胞凋亡不可逆轉。
　　 線粒體跨膜電位的存在,，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123,、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）],、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1],、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低,。
　　 方法：將正常培養(yǎng)的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM）,，JC-1（1mM），TMRM（100nM）,，37°C平衡30min,，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
　　 注意事項
　　 1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性,，因為pH值的變化將影響膜電位,。
　　 2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合,，降低染料的濃度,，引起假去極化。

四,、DNA檢測

　　細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder),。細胞經處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA,，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少,，還可在分離提純DNA后,，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影,，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成,。
　　 1. 大分子染色體DNA測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同,。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,，即達到分辨力的極限,。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣,，以其一端指向電場一極而通過凝膠,，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此,，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離,。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場,。每當電場方向改變后,，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后,，才能繼續(xù)向前移動,。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長,。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,，DNA就可以按其分子量大小分開。
　　 參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
　　 2． DNA Ladder 測定
　　 方法：收獲細胞（1X107）沉淀?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C,，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,，4°C一夜?14000rpm′15min?zui后將沉淀溶解在TE buffer中,，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相,。

3． 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
　　 方法：收集細胞,，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定置夜，PBS洗滌,，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色,，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化,。

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優(yōu)點：敏感度高,，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞,。如臨床活組織檢測,。

五 TUNEL法

　　細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下,，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,，從而可進行凋亡細胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）,。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成,，很少能夠被染色,。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征,，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片,、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定,，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用,。
六,、Caspase-3活性的檢測

　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子,，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能,。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段,，它被激活,，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物,，zui終導致細胞凋亡,。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降,。
　　 1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解,。
　　 方法：
　　 收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉,，室溫1.5~2h或4°C置夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C置夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次,， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色,。

2 熒光分光光度計分析
　　 原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵,。根據(jù)這一特點,，設計出熒光物質偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時,，AMC不能被激發(fā)熒光,，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光,。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小,，可以測定caspase-3的活性,，從而反映Caspase-3被活化的程度。
　　 方法：收獲細胞正?；虻蛲黾毎?，PBS洗滌，制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h,，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長380nm,，發(fā)射光波長為430-460nm）。

3 流式細胞術分析
　　 方法：收獲細胞正?；虻蛲黾毎?PBS洗滌,，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。

七,、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因,，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑,。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針,，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉位現(xiàn)象,，伴隨著細胞核形態(tài)學的變化,，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見,。同時我們發(fā)現(xiàn),，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一,。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義,，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉位,。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術和指標,。
　　 （一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
　　 材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體,，pH7.4 、0.15Mol/L PBS,，3%的多聚甲醛,，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20）,，胎牛血清,，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 ,。FACS管,，Tip頭,，移液器。
　　 儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱,，熒光顯微鏡,，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
　　 方法：
　　 1 懸浮細胞的染色：
　　 （1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106）,，PBS洗2次,，1000rpm′10min。
　　 （2）3%多聚甲醛冰浴10min,，PBS洗2次,，1000rpm′10min。
　　 （3）加入PBS-T溶液,，37°C孵育15min,，PBS洗2次，1000rpm′10min,。
　　 （4）加入200ml胎牛血清,，室溫反應30min。
　　 （5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40）,，4°C反應30min
　　 （6）熒光細胞洗液洗2次,，1000rpm 10min。
結果觀察：將細胞沉淀滴片,，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位,。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。

2：貼壁細胞的原位染色
　　 （1） 貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片）,，讓其爬片生長,，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞,。
　　 （2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色,，染色步驟同上。
　　 （3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上,，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位,。

3：臨床病理切片的染色、檢測,。
　　 4：原代細胞的培養(yǎng),、檢測。
　　 5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
　　 （二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
　　 1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態(tài)下,，以及疾病的不同時期,，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
　　 材料和試劑：
　　 1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
　　 2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　 3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
　　 4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
　　 5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
　　 6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　 7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,，ELISA
Reader（OD490nm）,，洗板機
　　 操作步驟
　　 1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C置夜（一般24h以上）,。
　　 2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液,，200 ml/well ,， 37°C孵育2h或4°C
置夜。
　　 3. 洗滌Buffer洗板三次,，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ,，37°C孵育1h。設包被Buffer,、洗滌Buffer ,、封閉液為陰性對照。
　　 4. 洗滌Buffer洗板三次,，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well,，37°C孵育1h。
　　 5. 洗滌Buffer洗板三次,，加入顯色液,，100 ml/well，避光反應10~15min,。
　　 6. 加入H2SO4終止反應,，50 ml/well。
　　 7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值,，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平,。
　　 8. Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。