大鼠皮質(zhì)醇(Cortisol)Elisa試劑盒說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定大鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中皮質(zhì)醇(Cortisol)含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗皮質(zhì)醇(Cortisol)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗皮質(zhì)醇(Cortisol)抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的皮質(zhì)醇(Cortisol)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為180 ng/ml,，做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后，分別稀釋成180 ng/ml,，90 ng/ml,，45 ng/ml，22.5 ng/ml,，11.25 ng/ml,，5.63 ng/ml，2.82 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制90 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 180 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μl/孔）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份

自備物品

1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）

2.   微量加液器及吸頭,，EP管

3.   蒸餾水或去離子水,，全新濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃置夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過1個(gè)月,，-80℃不應(yīng)超過2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí),，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,，如樣品濃度過高時(shí),，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2. 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl,，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測,。

注：

1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。  實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣或加試劑時(shí),，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育"時(shí)間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10μl）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7.  底物：底物請避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

    建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。

2.  自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的大鼠皮質(zhì)醇(Cortisol),，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。

檢測范圍：2.82 ng/ml - 180 ng/ml

zui低檢測限：1.41 ng/mL

說明

1. 只有全部使用試劑才能保證檢測效果,，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的,，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守試劑的試驗(yàn)說明才會(huì)得到*的檢測結(jié)果,。
2. 在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果,。
3. 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃,，其余試劑短期保存請置于4℃,，長期保存則置于-20℃。
4. 濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6. 所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
7. 有效期：6個(gè)月。
8. 本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半,。