人褪黑素(MT)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：25 ng/ml-400 ng/ml

zui低檢測限：12.5 ng/ml

特異性：本試劑盒可檢測人MT，且與其他相關物質無交叉反應,。

有效期：6個月

預期應用：ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關生物液體中MT含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。

實驗原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫直接競爭法檢測MT。微孔板上包被有抗體MT抗體,。加入MT標準品或樣品,，然后加入生物素標記的MT。樣品中的MT,、生物素標記MT與固相板上的抗MT抗體發(fā)生競爭結合,。再向微孔中加辣根過氧化物酶標記的親和素，形成固相抗體-生物素化MT-親和素-HRP復合物,。經加底物顯色后,，隨著樣品中MT濃度的升高，顯色OD值呈逐漸下降的線性關系,。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）,。
2. 標準品（Standard）：5×1ml/瓶。

1. 生物素標記MT：1×6ml/瓶,。
2. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶,。
3. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
4. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶,。
5. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
6. 終止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H₂SO4）,。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 超聲清洗器
5. 干凈的試管和Eppendof管
6. 系列可調節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
7. 蒸餾水,，容量瓶等

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內,，檢測的結果才是準確的,。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄,。zui后計算濃度時,，稀釋了“N"倍，標本的濃度應再乘以“N",。

濃洗滌液稀釋原則：

臨用前用蒸餾水進行20倍稀釋,。如有鹽析出，稀釋后水浴加溫助溶,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，先進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓?/span>不加任何溶液,，余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，然后在所有孔中加入50 ul 生物素標記MT（空白孔中不加）。盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應60分鐘（為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液）,。
2. 溫育后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板3-5次，每次浸泡10秒,，約200ul/每孔,，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標記親和素,。盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應30分鐘
4. 按步驟2進行洗滌,。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光顯色（30分鐘內,，一般10-15分鐘內,，此時肉眼可見標準品的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顏色不明顯,，即可終止）,。
6. 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測,。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零,。

3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡,。
2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。