大鼠神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細胞會不可避免地存留少量異質(zhì)細胞一同生長．為了后續(xù)實驗結(jié)果的針對性和準確性，一般都需要對培養(yǎng)物進行純化,。純化神經(jīng)元的方法有很多種,，zui簡便及常用的是采用有絲分裂抑制劑阿糖胞苷來抑制異質(zhì)細胞的存活和生長。神經(jīng)元的分化增殖完成于胚胎期,，大部分神經(jīng)元在出生后即為*的分裂后細胞,，但其他細胞則仍然不斷地進行分裂增殖，

使用有絲分裂抑制劑后,，非神經(jīng)元的細胞生長會受到抑制及淘汰,，神經(jīng)元由此得到純化

實驗材料：Hanks液，DMEM培養(yǎng)基10ml，有刻度吸管兩只,，彎頭吸管兩只,，無刻度吸管一只，新生乳鼠（24小時）0.05%胰酶,，1%雙抗,，10%胎牛血清，培養(yǎng)皿,，小燒杯,，空的離心管，鑷子,，剪刀,，酒精燈，酒精棉,，

實驗前準備工作：肥皂洗手,，新吉爾滅擦手，開通風(fēng)柜,，將吸管從套筒中取出放入各自對應(yīng)的試管內(nèi),，將橡皮塞安裝到各自吸管上，酒精燈分別迅速灼燒,，

1配液Hanks液近40ml加1%雙抗1ml,，加完雙抗的小吸管留作計數(shù)，在DMEM培養(yǎng)基中加10%胎牛血清（已配好,，全部加入）,，從離心管取一滴碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至溶液呈紫色，一離心管0.05%胰酶,，

2.取材,。乳鼠新生24小時。

3,，洗滌剪碎,，在培養(yǎng)皿中加入少許Hanks液洗滌，將乳鼠頭部用酒精棉擦拭消毒,，在乳鼠頭部位置剪一個工字型切口,，將皮膚顱骨沿著切口依次剪開剝離，取出大腦組織,，并去除乳鼠的血管腦膜,，用彎頭吸管將Hanks液與剝離干凈的腦組織移走到另一個干凈的培養(yǎng)皿中，用彎頭吸管洗走洗液,，彎頭吸管將含有腦組織的Hanks移入到小燒杯中剪碎，每個組織塊近似一立方毫米，靜置后洗走上面的Hanks液,，（吸取Hanks液時勿將下面的組織塊洗走）,，同樣方法再用Hanks液洗滌一次

4．酶解，加一離心管0.05%胰酶,，將上述小燒杯中的組織液移入空置的離心管中,，37攝氏度水浴10分鐘，觀察組織塊是否變小,，靜置2分鐘,，使組織沉淀下來，棄掉上請胰酶后,，加DMEM培養(yǎng)基（全部倒入）來中和胰酶,，吹散組織液

5.離心1200轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘,，棄掉上清液,，沉淀后加Hanks液吹散重懸組織液，用同樣的轉(zhuǎn)速和時間在離心一次,，加*培養(yǎng)基3-4mL吹散,，靜置1分鐘，以便消化大塊組織

6.計數(shù),，取0.1ml離心后的細胞液加入苔盤藍染色,，加樣搶加0.1微升與計數(shù)板計數(shù)，同時剩余細胞液加入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)接種,，標注好組別和時間,，培養(yǎng)細胞的名稱37攝氏度，二氧化碳培養(yǎng)箱中,，下周實驗課觀察細胞培養(yǎng)情況,。

7.計數(shù)結(jié)果：2.3×10⁶ ml

注意事項：

1. 實驗前保證乳鼠在冰塊內(nèi)冰凍數(shù)分鐘，頭朝下將乳鼠插入冰塊內(nèi),，
2. 玻璃腦膜血管時動作要迅速,，以免乳鼠蘇醒
3. 酒精燈應(yīng)放在離操作界面不遠處，保證其溫度
4. 用彎頭吸管吸取Hanks液時手腕旋轉(zhuǎn)
5. 第二遍在小燒杯中用Hanks液洗時,，要保證上請洗干凈,，否則胰酶濃度將會減低
6. *次水浴加熱時唔超過10分鐘，以免胰酶對組織產(chǎn)生損傷
7. 吹打時避免大力以及吹打出氣泡,，氣泡會導(dǎo)
8. 致細胞破裂,。吹打頻率可與秒表同步以保證每次操作的穩(wěn)定性和重復(fù)性。