小鼠Ⅲ型前膠原肽 (PⅢNP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

使用說明書 

（本試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!）

聲明：尊敬的客戶,，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品選用世界生產(chǎn)廠家的原料,，采用專業(yè)ELISA kit生產(chǎn)技術(shù)制造,。適用于體外定量檢測小鼠血清,、血漿,、組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清液中天然和重組PⅢNP濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分,！如有疑問,，請及時慧穎生物科技有限公司。

試劑盒組成：

*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法,。用抗小鼠PⅢNP抗體包被于酶標板上,，實驗時標本或標準品中的PⅢNP會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去,。依次加入生物素化的抗小鼠PⅢNP抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素,。抗小鼠PⅢNP抗體與結(jié)合在包被抗體上的小鼠PⅢNP結(jié)合,、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍色,，加終止液后變黃,。用酶標儀在450nm波長處測OD值，PⅢNP濃度與OD₄₅₀值之間呈正比,，通過繪制標準曲線求出標本中PⅢNP的濃度,。

標本收集:

1.     血清：全血標本于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原,，無內(nèi)毒素試管。

2.     血漿：抗凝劑推薦使用EDTA.Na2,，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測。避免使用溶血,，高血脂標本,。

3.     組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，以去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。zui后將勻漿液于5000×g 離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4.     細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測,。

5.     其它生物標本：1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測

（具體處理方法可參考：http://www.elabscience.cn/news2.asp?tid=477 ）

6.     標本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除,。

7.     標本收集后若不及時檢測,，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃冰箱內(nèi),，避免反復(fù)凍融,，1-6月內(nèi)檢測,4℃保存的應(yīng)在1周內(nèi)進行檢測。

8.     如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況,，做適當倍數(shù)稀釋(建議先做預(yù)實驗,，以確定稀釋倍數(shù))。

試驗所需自備物品:

1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器,，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙

檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25),。未用完的放回4℃,。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象,，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）,。
3. 標準品: 加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中,，靜置10分鐘，待其充分溶解后,，輕輕混勻(濃度為20ng/ml),。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度： 20,、10,、5、2.5,、1.25,、0.63、0.31,、0 ng/ml ,，樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/ml。如配制10ng/ml標準品：取0.5mL 20ng/ml的上述標準品加入含有0.5mL樣品稀釋液的EP管中,，混勻即可,，其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計）,，實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘,，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度,。當日使用。
   1. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計）,，實際配制時應(yīng)多配制  100-200μL,。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。當日使用,。

洗滌方法:

1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL,，注入與吸出間隔60秒。
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，在潔凈的吸水紙上拍干,，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在厚的吸水紙上拍干。

操作步驟:

實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,；試劑或樣品配制時，均需充分混勻,，并盡量避免起泡,。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μL,，余孔分別加標準品或待測樣品100μL,，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜,，37℃孵育90分鐘,。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2. 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL（在使用前15分鐘內(nèi)配制）,，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時,。
3. 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約350μL/每孔,，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100μL,，加上覆膜,，37℃溫育30分鐘。
5. 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，方法同步驟3,。
6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL,，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘,。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時,，即可終止）。
7. 每孔加終止液50μL,，終止反應(yīng),，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同,。
8. 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）,。應(yīng)提前打開酶標儀電源，預(yù)熱儀器,，設(shè)置好檢測程序,。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。

注意事項：

1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放,。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。

1. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
2. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔,。
3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜,；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，避免酶標板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度,。
4. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,，以免影響酶標儀讀數(shù),。
5. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋,，因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前,，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻,。標準品、生物素化抗體工作液,、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。請配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，一次不要小于10μL）,，以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、生物素化抗體工作液,、酶結(jié)合物工作液,。若需要分次使用標準品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存,。避免反復(fù)凍融,。
6. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。
7. 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
8. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率),，如無微量振蕩器,，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
9. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作,。特別是檢測血液或者其他體液標本時,，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行,。
10. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）
11. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用,，否則將影響試驗結(jié)果,！

結(jié)果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均值計算,。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標,，繪出標準曲線,。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標,，繪出標準曲線,。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3,，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。
3. 若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測,，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù),。

靈敏度、檢測范圍,、特異性和重復(fù)性:

● 靈敏度：zui小可測0.19ng/ml,。

● 檢測范圍：0.31 – 20ng/ml。

● 特異性：可檢測重組或天然的小鼠PⅢNP,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%,。

問題分析

說明

1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平,，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險,。
2. zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù)必準備充足的待測樣品,。
3. 只有全部使用Elab^TM試劑才能保證檢測效果,，不能混用其他制造商的產(chǎn)品,。只有嚴格遵守Elab^TM試劑的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。
4. 有效期：6個月,。
5. 本操作說明同樣適用于48T試劑盒,。