小鼠_TNF-α_elisa試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠TNF-α,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6 個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測定小鼠血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TNF-α

含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃(較長時間不用時),；2-8℃(頻繁使用時),。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任

何影響,。

概述

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一種具有多種生物活性的細胞因子,。兔子TNF-α

基因編碼前體蛋白，其信號肽將前體蛋白固定在細胞膜上,，成為具有活性的跨膜干擾素

(TNF),，分子質(zhì)量為26×103，經(jīng)酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α,，分子質(zhì)量為17×103,。

TNF-α細胞來源廣泛，包括各種免疫細胞,、內(nèi)皮細胞,、成纖維細胞,、表皮細胞、角質(zhì)細胞,、

平滑肌細胞,、星形細胞、成骨細胞等,。

TNF-α具有廣泛的生物學活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答,，抗腫瘤,，參與內(nèi)毒素性休

克等病理過程，引起惡病質(zhì)等,。其具有雙重作用,，,一方面在機體免疫調(diào)節(jié)，機體生理功能

和抗感染等方面發(fā)揮重要作用,，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會引起發(fā)熱!,、休克、惡

病質(zhì)等,，同時TNF-α可進一步誘導IL-6,、IL-8、IL-10 等細胞因子的產(chǎn)生,，這些促炎性細胞

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因子參與體內(nèi)急性反應(yīng),、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等,，還可使內(nèi)皮細胞活化而導致血管通

透性增加,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗TNF-α抗體的微孔中依次加入標本或標

準品,、生物素化的抗TNF-α抗體、HRP 標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色,。

TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺

和樣品中的TNF-α呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃

度,。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96 孔),。

2. 標準品(Standard)：2 瓶(凍干品)。

3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶,。

5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶,。

6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody)：1×120ul/瓶(1：100)

7. 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin)：1×120ul/瓶(1：100)

8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍,。

10. 終止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof 管

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5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存

1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃一夜后于1000 x g 離心20 分鐘,，取上清即可

檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融,。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心15

分鐘，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮?/span>

放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標準

曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中,，應(yīng)做好詳細的記錄,。zui后計算濃度

時,，稀釋了“N”倍,，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2 瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10 分鐘以上，

然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為2000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000

pg/ml，1000 pg/ml,，500 pg/ml,，250 pg/ml，125 pg/ml,，62.5 pg/ml,，31.2 pg/ml，樣品稀釋液

直接作為標準濃度0 pg/ml,，臨用前15 分鐘內(nèi)配制,。

如配制1000 pg/ml 標準品：取0.5ml(不要少于0.5ml)2000 pg/ml 的上述標準品加入含0.5ml

樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制

(每孔100ul),，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul 生物素標記抗體加990ul 生物素標

記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

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臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的

總量配制(每孔100ul),，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul 辣根過氧化物酶標記親和

素加990ul 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)

配制,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。

每次檢測都應(yīng)該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試

劑盒的檢測范圍,。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標

準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，

輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100ul(取1ul 生物素標記抗

體加99ul 生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制)，37℃,60

分鐘,。

3. 溫育60 分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3 次,，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔,，甩干,。

4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100ul，37℃,，60

分鐘,。

5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘,，350ul/每孔,，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色(30 分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4 孔

有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯,，即可終止),。

7. 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),。終止液的加入順序應(yīng)盡量與

底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度(OD 值),。在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進

行檢測。

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注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。

測量時先用此孔調(diào)OD 值至零,。

3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。標準品,、生物素標記抗體工作液,、辣根過

氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生

物素標記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，

酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘,。根據(jù)需

要,，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD 值為縱坐標(普通坐標),，在半對數(shù)坐標紙上

繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準

物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD 值代入方程式,，計算出

樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡,。

2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。

5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

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6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

7. 底物請避光保存,。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

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