詳細介紹
儲存條件:4℃,6個月
用途:占據固相化過程的空白點,,以減少非特異性反應,。
注意事項:由磷酸鹽、明膠等組成,。
公司產品僅用于科研具有質量可靠,、效果穩(wěn)定、靈敏度高,、操作簡單,、易保存等特點,咨詢并訂購,!
產品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
ELISA封閉液 | 100ml | FS-R7295 |
配制與標定的實驗原理:
1,、用EDTA二鈉鹽配制EDTA標準溶液的原因;
EDTA是四元酸,是一種白色晶體粉末,,常用H4Y表示,,溶解度很小,室溫溶解度為0.02g/100g H2O,。
2,、標定EDTA標準溶液的工作基準試劑,基準試劑的預處理:稱量前一般應先用稀鹽酸洗去氧化層,,然后用水洗凈,,烘干。
配制步驟:
1,、取適量鋅片放在100mL燒杯中,,用0.1mol·L-1 HCl溶液(自配)清洗1min,再用自來水,、純水洗凈,,烘干、冷卻,。
2,、用直接稱量法在干燥小燒杯中準確稱取0.15~0.2g Zn,蓋好小表面皿,。
3,、用滴管從燒杯口加入5mL 1:1 鹽酸,待Zn溶解后吹洗表面皿,、杯壁,,小心地將溶液轉移至250mL容量瓶中,用純水稀釋至標線,,搖勻,。
實驗方法與判定:
1.對照品溶液的穩(wěn)定性
2.對照品溶液的配制:精密量取腦對照品適量,加無水乙醇制成每1ml含腦1mg的溶液,,作為對照品溶液,。
3.色譜條件:以交聯(lián)鍵合聚乙二醇為固定相的毛細管柱;柱溫120℃,;進樣口溫度250℃;檢測器溫度250℃,;分流進樣,,分流比10:1。理論塔板數(shù)按腦計算應不低于10000,。
4.實驗方法:配制的對照品溶液,,一份置冷處保存,一份置室溫中保存,,在第1,、3,、7、10,、15天重新配制一份對照品溶液,,三種儲備液同時稀釋制成每1ml中約含50ug的溶液。照氣相色譜法,,并依據新對照品的峰面積計算原對照品溶液的含量,。記錄下來,保證原對照品溶液含量在考察期相對平均偏差不超過2.0%,,驗證對照品溶液在使用期內穩(wěn)定可靠,。
使用方法:
1. 常用篩選濃度
注意:用來篩選穩(wěn)轉株的工作濃度需要根據細胞類型,培養(yǎng)基,,生長條件和細胞代謝率而變化,,推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對于第一次使用的實驗體系建議通過建立殺滅曲線(kill curve),,即劑量反應性曲線,,來確定最佳篩選濃度。
一般而言,,哺乳動物細胞50-500μg/mL,;細菌/植物細胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL,。
2. 殺滅曲線的建立
注意:為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株,,需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應曲線)來實現(xiàn),,至少選擇5個濃度,。
1) 第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,37℃,,CO2培養(yǎng)過夜,;注:對于需要更高密度來檢測活力的細胞,可增加接種量,。
2) 根據細胞類型,,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例,,可設定50,,100,250,,500,,750,1000μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml,,然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液,。
3) 第二天:替換舊的培養(yǎng)基,換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基,。每個濃度做三個平行孔,。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期(如每2天)進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度,。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10天)內能夠殺死絕大多數(shù)細胞的濃度為穩(wěn)定轉染細胞篩選用的工作濃度,。
3. 穩(wěn)定轉染細胞的篩選
1) 轉染48h后,用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細胞(直接傳代或者稀釋后傳代),。
注意:細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷,。則當細胞過于稠密,其效率會降低,。為了得到較好的篩選效果,,最好將細胞稀釋至豐度不超過25%
2) 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3) 篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r,。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,這取決于宿主細胞類型,,轉染,,以及篩選效果。
4) 挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養(yǎng)板,,繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天,。
5) 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
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