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二、細胞培養(yǎng)操作

1) 復蘇細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主,。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000 rpm條件下離心3 min,，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中,，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2) 細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

a,、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，使消化液浸潤所有細胞,，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min（視細胞消化情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml培養(yǎng)基終止消化,。輕輕打勻后裝入無菌離心管中,，1000 rpm離心5 min，棄去上清液,，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻,。

c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

3) 細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面 T25 瓶為例,；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS,，進行細胞計數。

b,、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液,，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻,，每支凍存管凍存1mL細胞懸液,，注意凍存管做好標識。

c,、將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

原代細胞與細胞系有什么區(qū)別,？

原代細胞是指從人體或動物組織中直接分離出來的細胞，具有非常高的活性,。這些細胞通常需要在實驗室中進行培養(yǎng)和擴增,，以獲得足夠的數量用于實驗和研究。由于原代細胞是直接從組織中分離出來的,，因此它們保留了原始細胞的特性和功能,，可以更好地模擬體內環(huán)境。但是,，原代細胞通常只能在有限的時間內保持活性,，并且容易受到環(huán)境因素的影響，因此需要進行及時的保存和更新,。

細胞系(cell line)是原代細胞經shou次傳代成功后即為細胞系,。泛指一般可能傳代的細胞。其中能夠連續(xù)傳代的細胞叫做連續(xù)細胞系或無限細胞系,，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細胞系,。大多數二倍體細胞為有限細胞系。由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成,。如果不能繼續(xù)傳代,，或傳代次數有限， 可稱為有限細胞系(finite cell line),， 如可以連續(xù)培養(yǎng),， 則稱為連續(xù)細胞系(continuous cell line),， 培養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去,。人類腫瘤細胞,，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定,，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系,。

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