甘油PBS封片劑公司正在銷售的產(chǎn)品：大鼠白介素1β(IL-1β)試劑盒Anti-NEFM Antibody小鼠可溶性肌球蛋白重鏈1
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產(chǎn)品分類：免疫組化

儲存條件：室溫,12個月

用途：常規(guī)切片和細胞涂片的封固,亦可以用于免疫組化的封閉

注意事項：主要由甘油,、磷酸鹽等組成。如果需要長期保存都要用油漆或者中性樹膠進行封邊,，否則時間長了容易吸水或干燥,，使材料變壞。

公司產(chǎn)品僅用于科研具有質(zhì)量可靠,、效果穩(wěn)定,、靈敏度高、操作簡單,、易保存等特點,，咨詢并訂購,！

 

 

 

配制與標定的實驗原理：

1、用EDTA二鈉鹽配制EDTA標準溶液的原因,；

EDTA是四元酸,，是一種白色晶體粉末，常用H4Y表示,，溶解度很小,，室溫溶解度為0.02g/100g H2O。

2,、標定EDTA標準溶液的工作基準試劑,，基準試劑的預(yù)處理：稱量前一般應(yīng)先用稀鹽酸洗去氧化層，然后用水洗凈,，烘干,。

配制步驟：

1、取適量鋅片放在100mL燒杯中,，用0.1mol·L-1 HCl溶液（自配）清洗1min,，再用自來水、純水洗凈,，烘干,、冷卻。

2,、用直接稱量法在干燥小燒杯中準確稱取0.15～0.2g Zn,，蓋好小表面皿。

3,、用滴管從燒杯口加入5mL 1:1 鹽酸,，待Zn溶解后吹洗表面皿、杯壁,，小心地將溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中,，用純水稀釋至標線，搖勻,。

 

 

實驗方法與判定：

1.對照品溶液的穩(wěn)定性

2.對照品溶液的配制：精密量取腦對照品適量,，加無水乙醇制成每1ml含腦1mg的溶液，作為對照品溶液,。

3.色譜條件：以交聯(lián)鍵合聚乙二醇為固定相的毛細管柱,；柱溫120℃；進樣口溫度250℃,；檢測器溫度250℃,；分流進樣，分流比10:1,。理論塔板數(shù)按腦計算應(yīng)不低于10000,。

4.實驗方法：配制的對照品溶液,，一份置冷處保存，一份置室溫中保存,，在第1,、3、7,、10、15天重新配制一份對照品溶液,，三種儲備液同時稀釋制成每1ml中約含50ug的溶液,。照氣相色譜法，并依據(jù)新對照品的峰面積計算原對照品溶液的含量,。記錄下來,，保證原對照品溶液含量在考察期相對平均偏差不超過2.0%，驗證對照品溶液在使用期內(nèi)穩(wěn)定可靠,。

使用方法：

1.  常用篩選濃度

注意：用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細胞類型,，培養(yǎng)基，生長條件和細胞代謝率而變化,，推薦使用濃度為50-1000μg/mL,。對于第一次使用的實驗體系建議通過建立殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線,，來確定最佳篩選濃度,。

一般而言，哺乳動物細胞50-500μg/mL,；細菌/植物細胞20-200μg/mL,；真菌300-1000μg/mL。

2. 殺滅曲線的建立

注意：為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株,，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細胞的抗生素濃度,，可通過建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來實現(xiàn)，至少選擇5個濃度,。

1）  第一天：未轉(zhuǎn)化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,，37℃，CO2培養(yǎng)過夜,；注：對于需要更高密度來檢測活力的細胞,，可增加接種量。

2）  根據(jù)細胞類型,，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度,。以哺乳動物細胞為例，可設(shè)定50,，100,，250,，500，750,，1000μg/mL,。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml，然后按照下表稀釋到相應(yīng)濃度的工作液,。

3）  第二天：替換舊的培養(yǎng)基,，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔,。

4）  接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基,。

5）  按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細胞的濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選用的工作濃度,。

3.   穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選

1）  轉(zhuǎn)染48h后,，用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

注意：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷,。則當細胞過于稠密,，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果,，最好將細胞稀釋至豐度不超過25%

2）  每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液,。

3）  篩選7天后觀察并評估細胞克隆（集落）的形成情況,。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,，這取決于宿主細胞類型，轉(zhuǎn)染,，以及篩選效果,。

4）   挑取并轉(zhuǎn)移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天,。

5）   之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可,。

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