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用于染色的培養(yǎng)細(xì)胞既可以是貼壁細(xì)胞，也可以是懸浮細(xì)胞,。貼壁細(xì)胞通常使其生長在合適的固相支持物上,；懸浮細(xì)胞可以直接固定，也可以通過甩片或使用化學(xué)黏合劑黏附在固相支持物上,。（一）貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞的準(zhǔn)備比較簡單,，可以使其生長于適當(dāng)?shù)妮d玻片、蓋玻片或塑料組織培養(yǎng)皿中,。如果實驗要求高分辨率或需拍照,，細(xì)胞應(yīng)生長于載玻片或蓋玻片上；如果實驗的分辨率要求不高,，或者是大量樣品的篩選,，可使細(xì)胞生長于塑料組織培養(yǎng)皿中。將貼壁細(xì)胞生長在固相支持物上有其*的優(yōu)點,，操作步驟,，如沖洗、固定,、通透及染色均較簡單易行,，便于同時進
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處理懸浮細(xì)胞的一個簡單辦法是在固定細(xì)胞之前把細(xì)胞黏附在固相支持物上。方法之一是使用甩片機,。細(xì)胞在固定之前,，用特殊的離心方法將細(xì)胞甩至載玻片上。需要注意的是離心力可使細(xì)胞壓癟并擴張,，使抗體更容易結(jié)合細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),，但也輕微扭曲了正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。1．所需溶液和儀器PBS及甩片機,。2．操作步驟（1）用PBS洗滌細(xì)胞（400r/min2X106／m1,；離心5min），并重懸于PBS中,。調(diào)整濃度至1～（2）將顯微鏡載玻片固定于甩片機的轉(zhuǎn)頭上,，然后加入0．1—0．5ml細(xì)胞懸液；（3）迅速使離心力達到1200
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[器材和試劑]●包被緩沖液●PBST●PBBST[PBS,，1％TritonX—100，3％BSA（Sigma）]●兔抗人Fc—特異性IgG（Pierce）：用包被緩沖液稀釋為5．0ug/ml①●HRP標(biāo)記的抗噬菌體抗體（AmershamBiosciences）：用封閉液以1/10000比例稀釋●顯色液[3,，3’,，5,，5’—四甲基聯(lián)苯胺（TMB）液體底物系統(tǒng)，Sigma][方法]1．將200ul兔抗人Fc—特異性IgG等量分加到各孔中,。4℃孵育過夜,。2．用PBST洗滌多孔板。3．加250ulPBB
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每一輪的親和選擇包括原始的或富集的gⅥ—cDNA文庫中噬菌粒顆粒的獲取和純化以及它們自身的淘選過程,。介紹兩種不同的方法來抽提特異的噬菌體,。1噬菌體文庫的獲取和純化在每輪淘選循環(huán)中的起始部分，（富集的）Topl0F,，細(xì)胞經(jīng)輔助噬菌體被雙重感染以便產(chǎn)生和純化gⅥ—cDNAt噬菌粒顆粒,，從而進行下一輪的淘選。在淘選過程中,，如果沒有特異的緩沖液且噬菌體對誘餌的親和力較高（如免疫親和篩選）,，此時經(jīng)雙重感染獲得的噬菌體顆粒并不一定要純化。2生物素化的誘餌的制備用不同的配體標(biāo)準(zhǔn)化淘選的一個方法是用普通的標(biāo)記物
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蛋白酶分類作用位點已知抑制物氨基肽酶金屬蛋白酶帶有自由氨基的L-氨基酸氨基末端,；不能分解由X-Pro,、·D或·Q組成的肽鍵2，2,，雙吡啶,，1．1（）-菲咯啉菠蘿蛋白酶巰基蛋白酶無特異性α2巨球蛋白，TPCK,，TLCK,，烷化羧肽酶A鋅金屬蛋白酶帶有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R,、P或羥脯氨酸EDTA,，EGTA羧肽酶B鋅金屬蛋白酶K，R羧基端EDTA,，EGTA,，堿性氨基酸羧肽酶Y絲氨酸羧肽酶氨基酸羧基端PMSF組織蛋白酶C琉基蛋白酶氨基端雙肽，可通過K,，R或P氨基端作為第二或第三個氨基酸封
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TCA沉淀——過濾法1．為了檢測放射性標(biāo)記物結(jié)合蛋白質(zhì)的摻入量,，每個樣本吸取一定量（通常為5／／1）加入盛有100t~lBSA溶液（1mg／m1）的1．5m1錐形管中,。2．每管加入lmll0％冰冷的三氯醋酸，混勻,。3．冰上孵育30min,。4．將玻璃纖維濾紙置于一適當(dāng)?shù)倪^濾器上，用少量的10％三氯醋酸真空過濾，預(yù)先濕潤濾紙,。5．滴加樣本于濾紙的中央,，而末摻入標(biāo)記物則通過濾紙除去，被TCA沉淀的蛋白質(zhì)則吸附在濾紙上,。6．再用少量的10％三氯醋酸（數(shù)毫升）洗滌2次,。7．用少量的95％乙醇洗滌2次。8．
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疾病診斷,、細(xì)菌鑒定，關(guān)鍵在鑒定毒素,。從材料中如能迅速檢出毒素為,，檢出速度快，治療預(yù)防能及時,。從癥狀,、流行病學(xué)懷疑肉毒癥后，應(yīng)先千方百計地在極短時期內(nèi)證明檢材中是否有肉毒梭菌毒素,，搶時間救人,。在設(shè)法證明毒素存在的同時，進行細(xì)菌分離,、鑒定及產(chǎn)毒能力測定,。（1）檢驗程序檢驗菌株是否產(chǎn)生肉毒毒素，或污染食品中是否有產(chǎn)毒素的肉毒梭菌存可按圖進行檢驗,。檢樣接種肝湯35℃培養(yǎng)3天檢樣接種TPCYT肉湯2℃培養(yǎng)5天↓↓取液體部分7000r/min離心30min↓取上清中過滅菌↓↓↓血清學(xué)試驗禽眼瞼閉合試驗小白鼠
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本實驗是以質(zhì)體pBluescriptIISK（-）為材?,，以?同限制酶作用，經(jīng)電泳分離DNA片段后,，比較各DNA片段的泳動?與分子?,，藉此練習(xí)限制酶的使用、電泳分析及簡?DNA限制圖譜（restrictionmap）的建?,。以DNA操作為主的各項實驗必須維持溶液與容器?受核酸分解酵素污染,，因此請同學(xué)遵守以下原則并養(yǎng)成習(xí)慣：a.請隨時保持實驗桌的清潔。b.微?移液器頭及微?離心管取出后?即將蓋子蓋上,。c.請勿用手觸摸滅過菌的微?移液器頭,、微?離心管及各種容器的內(nèi)部。d.溶液打開后,，蓋子請勿隨意置放
