聯(lián)系電話
上海寶葉生物科技有限公司
中級會員·6年
- 聯(lián)系人：
- 蔣先生
- 電話：
- 手機：
- 13391038817
- 地址：
- 上海市嘉定區(qū)新源路155弄
- 個性化：
- www.shjsbio.com
- 網(wǎng)址：
- www.shjsbio.com
掃一掃訪問手機商鋪
每一輪的親和選擇包括原始的或富集的gⅥ—cDNA文庫中噬菌粒顆粒的獲取和純化以及它們自身的淘選過程。介紹兩種不同的方法來抽提特異的噬菌體,。
1噬菌體文庫的獲取和純化
在每輪淘選循環(huán)中的起始部分，（富集的）Topl0F,，細(xì)胞經(jīng)輔助噬菌體被雙重感染以便產(chǎn)生和純化gⅥ—cDNAt噬菌粒顆粒,，從而進(jìn)行下一輪的淘選。在淘選過程中,，如果沒有特異的緩沖液且噬菌體對誘餌的親和力較高（如免疫親和篩選）,，此時經(jīng)雙重感染獲得的噬菌體顆粒并不一定要純化。
2生物素化的誘餌的制備
用不同的配體標(biāo)準(zhǔn)化淘選的一個方法是用普通的標(biāo)記物（如生物素）來標(biāo)記誘餌,，或使用鏈霉親和素包被的酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的平板孔或小珠來淘選,。兩個有效的（氨基反應(yīng)的）生物素化試劑是二硫化N—羥基丁二酰亞胺生物素酯（biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester）和生物素化氨基己酸—N—羥基丁二酰亞胺（biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide）（Sigma）。與后者試劑相比,，前者在生物素和誘餌之間有一個可切斷的二硫鍵,，它是在生物淘選過程中特異抽提（用50mmol/L二硫蘇糖醇）噬菌體的試劑，整個生物素的水平可用HABA方法來評估,。
3用生物素化的誘餌的淘選過程
在用生物素化的誘餌來親和純化gⅥ—cDNA噬菌體顆粒的標(biāo)準(zhǔn)過程中,，用鏈霉親和素包被的磁珠預(yù)處理噬菌粒文庫，以便首先除去與鏈霉素非特異結(jié)合的噬菌體顆粒,。在第三輪淘選后,，個別克隆可用ELISA來分析或進(jìn)行額外的淘選過程。然而，必須注意到成功的展示要求pⅥ融合蛋白定位在外周胞質(zhì)上,，正確地折疊并組合成完整的噬菌體顆粒,。這樣的話，如果表達(dá)pⅥ融合蛋白的結(jié)合者干擾了選擇過程,，那么將會稀釋“非干擾”結(jié)合者的濃度,。
4免疫親和淘選過程
用抗血清來分離gⅥ—cDNA噬菌體顆粒，而且所需要的抗血清是微量的（微升數(shù)量的）,。
