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gⅥ-cDNA融合噬菌體親和選擇

2012-9-18  閱讀(1568)

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每一輪的親和選擇包括原始的或富集的gⅥ—cDNA文庫中噬菌粒顆粒的獲取和純化以及它們自身的淘選過程,。介紹兩種不同的方法來抽提特異的噬菌體,。

 
     1噬菌體文庫的獲取和純化
    在每輪淘選循環(huán)中的起始部分,(富集的)Topl0F,,細胞經(jīng)輔助噬菌體被雙重感染以便產(chǎn)生和純化gⅥ—cDNAt噬菌粒顆粒,,從而進行下一輪的淘選。在淘選過程中,,如果沒有特異的緩沖液且噬菌體對誘餌的親和力較高(如免疫親和篩選),,此時經(jīng)雙重感染獲得的噬菌體顆粒并不一定要純化。
 
    2生物素化的誘餌的制備
    用不同的配體標準化淘選的一個方法是用普通的標記物(如生物素)來標記誘餌,,或使用鏈霉親和素包被的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)的平板孔或小珠來淘選,。兩個有效的(氨基反應(yīng)的)生物素化試劑是二硫化N—羥基丁二酰亞胺生物素酯(biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester)和生物素化氨基己酸—N—羥基丁二酰亞胺(biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide)(Sigma)。與后者試劑相比,前者在生物素和誘餌之間有一個可切斷的二硫鍵,,它是在生物淘選過程中特異抽提(用50mmol/L二硫蘇糖醇)噬菌體的試劑,,整個生物素的水平可用HABA方法來評估。
 
    3用生物素化的誘餌的淘選過程
    在用生物素化的誘餌來親和純化gⅥ—cDNA噬菌體顆粒的標準過程中,,用鏈霉親和素包被的磁珠預(yù)處理噬菌粒文庫,,以便首先除去與鏈霉素非特異結(jié)合的噬菌體顆粒。在第三輪淘選后,,個別克隆可用ELISA來分析或進行額外的淘選過程,。然而,必須注意到成功的展示要求pⅥ融合蛋白定位在外周胞質(zhì)上,,正確地折疊并組合成完整的噬菌體顆粒,。這樣的話,如果表達pⅥ融合蛋白的結(jié)合者干擾了選擇過程,,那么將會稀釋“非干擾”結(jié)合者的濃度,。
 
    4免疫親和淘選過程
    用抗血清來分離gⅥ—cDNA噬菌體顆粒,而且所需要的抗血清是微量的(微升數(shù)量的),。

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