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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意:正式測(cè)定之前選擇預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。


規(guī)格:100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存,。試劑二:液體 22mL×1 瓶,,4℃保存。

試劑三:粉劑×1 瓶,,4℃保存,。臨用前加 2 mL 蒸餾水溶解。

產(chǎn)品說(shuō)明:

微量法

GST 是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,,主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),。GST 是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與 GSH 的巰基共價(jià)結(jié)合,,使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),,易于從膽汁或尿液中排泄,達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的,。因此,,GST 在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外,,因?yàn)?GST 具有 GSH-Px 活性,,亦稱為 non-Se GSH-Px,具有修復(fù)氧化破壞的大分子如 DNA、蛋白質(zhì)等的功能,。注意,,GST 催化的反應(yīng)減少 GSH 含量,但是不增加 GSSG 含量,。

GST 催化 GSH 與 CDNB 結(jié)合,,其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長(zhǎng)為 340nm;通過(guò)測(cè)定 340nm 波長(zhǎng)處吸光度上升速率,,即可計(jì)算出 GST 活性,。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)節(jié)移液器,、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔

UV 板和蒸餾水,。

操作步驟:

一,、粗酶液提取:

1.組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,,加入 1mL

試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g,4℃離心 10min,,取上清置冰上待測(cè),。

2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一),,冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,,超聲 3 秒,間隔 7 秒,,總時(shí)間 3min),;然后 8000g,4℃,,離心 10min,,取上清置于冰上待測(cè)。

3 .血清等液體:直接測(cè)定,。二,、測(cè)定:

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm,,用蒸餾水調(diào)零,。

2.試劑二放在 25℃(一般物種)或者 37℃(哺乳動(dòng)物)保溫。

3.空白管:取微量石英比色皿,,加入 20μL 試劑一,,180μL 試劑二和 20μL 試劑三,,迅速混勻后于

340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A1,37℃水浴 5min 后,,快速取出測(cè)定吸光度記 A2,。

4.測(cè)定管:取微量石英比色皿,加入 20μL 上清液,,180μL 試劑二和 20μL 試劑三,,迅速混勻后于


340nm 測(cè)定 10 s 吸光度記 A3,37℃水浴 5min 后,,快速取出測(cè)定吸光度記 A4,。三、GST 活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位,。

GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr

2.按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位,。

GST(U/g 鮮重)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W

3.按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST(U/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷500

4.按液體體積計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位,。

GST(U/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T

=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]

ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103 L/mol /cm,;d:比色皿光徑,,1cm,;106:1mol=1×106μmol,;V 反總:反應(yīng)體系總體積,220μL=2.2×10-4  L,;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),,需要另外測(cè)定,建議選用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒,;W :樣品質(zhì)量,,g;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,,20μL=0.02 mL,;V 樣總:試劑一體積,1 mL,;T:反應(yīng)時(shí)間(min),,5min;500:細(xì)胞數(shù)量,, 500 萬(wàn),。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST(U/mg prot)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每克樣品每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活性單位,。

GST(U/g 鮮重)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W




(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位,。

GST(U/104 cell)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷500

(4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:在 25℃或者 37℃中,,每毫升液體每分鐘催化 1μmol CDNB 與 GSH 結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST(U/mL)=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反總÷V 樣÷T

=0.38×[(A4-A3)-(A2-A1)]

ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),,9.6×103 L/mol /cm,;d:96 孔板光徑,0.6cm,;106:1mol=1×106μmol,;V 反總:反應(yīng)體系總體積,220μL=2.2×10-4  L,;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),,需要另外測(cè)定,建議選用本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒,;W :樣品質(zhì)量,;V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL,;V 樣總:加入試劑一體積,,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),,5min,;500:細(xì)胞數(shù)量,500 萬(wàn),。

注意事項(xiàng):

1.樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力;

2.細(xì)胞中 GST 活性測(cè)定時(shí),,細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間,,細(xì)胞中 GST 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,;

3.測(cè)定前先用 1~2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),,如 5min 內(nèi)反應(yīng)不成線性,須對(duì)樣品用蒸餾水稀釋,,計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),;

4.若樣品測(cè)定吸光度大于 1,建議對(duì)樣品用蒸餾水稀釋,,計(jì)算時(shí)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),;

5.測(cè)定反映的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響,,請(qǐng)控制在 25℃或者 37℃(哺乳動(dòng)物)。

從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域,、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤(rùn)色服務(wù),,協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色十余年,是您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時(shí)間,、試驗(yàn)條件等限制而無(wú)法完成您的課題研究,,歡迎您與我們聯(lián)系。

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