Western blot 實驗注意事項

1. 配膠時，建議先加水,， 再加Tris-HCL緩沖液,，并且每加一種液體就混勻膠液,。加入的TEMED有毒,，務(wù)必在通風(fēng)櫥中操作， 并且加入后立即混勻,、灌膠,。丙烯酰胺未聚合的單體有神經(jīng)毒性， 能夠經(jīng)皮膚吸收,， 需戴手套操作,。

2. AP作為催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體聚合， TEMED作為加速劑能夠促進AP釋放氧自由基,，加速丙烯酰胺單體的聚合,。空氣溫度較低時稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度,，但要確保AP未變質(zhì),，否則無效。

3. AP應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,， 否則變質(zhì)會導(dǎo)致膠不聚合,。另外， TEMED添加過量會使膠凝得過快并且孔徑大小不一,，影響蛋白的電泳,，甚至可能燒膠。

4. 電泳內(nèi)槽中應(yīng)加入新鮮的電泳液,， 并且應(yīng)先拔梳子再安裝入電泳槽,， 添加電泳液。這樣能夠沖洗掉各孔中碎膠,， 確保電泳時條帶平直,。

5. 建議兩邊加入預(yù)染的Protein Marker，方便觀察不同KDa蛋白的分離情況,，也方便后續(xù)的裁膜,。

6. 電轉(zhuǎn)液中一般需加入甲醇或乙醇,， 而電轉(zhuǎn)時的放熱會加速醇類的揮發(fā)進而影響下一次重復(fù)使用時的電轉(zhuǎn)效果。重復(fù)使用電轉(zhuǎn)液時應(yīng)考慮到醇類的揮發(fā)而適當延長電轉(zhuǎn)時間,， 最好是每次電轉(zhuǎn)時都使用新的電轉(zhuǎn)液,。不同KDa的蛋白電轉(zhuǎn)的條件不同， 所以可以針對目的蛋白進行切膠,， 然后在不同條件下電轉(zhuǎn),。

7. 蓋上PVDF膜后， 不要再輕易移動,， 否則條帶會模糊,。兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路,，蛋白會轉(zhuǎn)不過來,。

8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA，建議建議做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白） 作為封閉液,。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白）,，如果用奶粉，有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象,。并且脫脂奶粉含磷酸酶,， 磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化， 用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響,。

9. 一抗在四度孵育時能夠延緩抗體的衰減速度,， 提高重復(fù)利用的次數(shù)。建議嚴格按照要求進行洗膜,， 不要輕易減少洗膜的次數(shù)和時間,。Tween20作為一種非離子表面活性劑， 能夠減少非特異性的抗體結(jié)合,， 降低背景,。所以如果曝光后發(fā)現(xiàn)背景高，可以將1XPBST/TBST中Tween20從0.05%提高到0.5%,，并且增加洗膜次數(shù),。

10. 曝光時盡量將目標蛋白和內(nèi)參一起曝光， 便于比較,。如果使用傳統(tǒng)的壓片曝光,， 可以壓兩張甚至更多的片子并折角， 折角可以確定方向,， 增加壓片數(shù)量可以控制曝光強度,。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況， 離膜遠的蛋白可以保證亮度強的蛋白不過曝,。

11. 曝光時多使用ECL發(fā)光試劑盒,， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度,， 而內(nèi)參等含量較多的蛋白則應(yīng)使用普通的ECL發(fā)光試劑防止過亮，阻礙曝光,。

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