一氧化氮（Nitric oxide,，NO）含量測定試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

測定意義：

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內神經,、循環(huán),、呼吸、消化,、泌尿生殖等系統(tǒng)中,， 特別是神經組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質,，發(fā)揮信號傳遞的作用,，是一

種新型的生物信使分子，在機體的生理,、病理過程中起著重要的作用,。

測定原理：

NO 在體內或水溶液中極易氧化生成 NO2— ，在酸性條件下,，NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物,，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在 550nm 處有特征吸收峰,，測定其吸光值,， 可以計算 NO 含量。

自備實驗用品及儀器：

天平,、研缽或勻漿器,、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板,、蒸餾水,。 試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL× 1 瓶,，4℃保存。

試劑一：液體 6mL× 1 瓶,，4℃避光保存,。（用之前震蕩溶解后使用）

試劑二：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存,。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)

樣品處理：

1.    組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織,，

加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿。10000g ,，4℃離心 15min ,，取上清，置冰上待測,。

2.    細菌,、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w ,，超聲 3 秒,，間隔 7 秒，總時間 3min）,；然后 10000g ,，4℃ , 離心 15min ，取上清置于冰上待測,。

3.    體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定,。

測定步驟和操作表：

1 、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調節(jié)波長至 550nm,。

2 、操作表

NO 含量計算：

a.   用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103 ,，R2= 0. 9986

1 、組織樣品：

（1）按樣本質量計算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷Cpr

2 ,、細胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）× 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷細胞數(shù)量（萬個）

3 ,、其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣

= 125×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應總體積，0.2mL,；V 樣：反應中樣品體積,，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積,，

1mL,；W：樣品質量,，g；Cpr：蛋白濃度,，mg/mL

b.   用 96 孔板測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103 ,，R2= 0. 9986

1 、組織樣品：

（1）按樣本重量計算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷ Cpr

2 ,、細胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）× 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷細胞數(shù)量（萬個）

3 ,、 其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣=250×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應總體積，0.2mL,；V 樣：反應中樣品體積,，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積,， 1mL；W：樣品質量,，g,；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

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