一氧化氮（Nitric oxide,，NO）含量測定試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

NO（Nitric Oxide,，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng),、循環(huán)、呼吸,、消化,、泌尿生殖等系統(tǒng)中， 特別是神經(jīng)組織中較豐富,。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì),，發(fā)揮信號傳遞的作用，是一

種新型的生物信使分子,，在機體的生理,、病理過程中起著重要的作用。

測定原理：

NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2— ,，在酸性條件下,，NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合,，產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰,，測定其吸光值， 可以計算 NO 含量,。

自備實驗用品及儀器：

天平,、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96 孔板,、蒸餾水,。 試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL× 1 瓶，4℃保存,。

試劑一：液體 6mL× 1 瓶,，4℃避光保存。（用之前震蕩溶解后使用）

試劑二：液體 6mL× 1 瓶,，4℃避光保存,。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)

樣品處理：

1.    組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，

加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿,。10000g ,，4℃離心 15min ，取上清,，置冰上待測,。

2.    細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ,，超聲 3 秒，間隔 7 秒,，總時間 3min）；然后 10000g ,，4℃ , 離心 15min ,，取上清置于冰上待測。

3.    體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定,。

測定步驟和操作表：

1 ,、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 550nm,。

2 ,、操作表

NO 含量計算：

a.   用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103 ,，R2= 0. 9986

1 ,、組織樣品：

（1）按樣本質(zhì)量計算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷Cpr

2 、細(xì)胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

3 ,、其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣

= 125×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積,，0. 1mL,；V 樣總：加入提取液體積,，

1mL；W：樣品質(zhì)量,，g,；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

b.   用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103 ,，R2= 0. 9986

1 ,、組織樣品：

（1）按樣本重量計算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷ Cpr

2 、細(xì)胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

3 ,、 其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣=250×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積,，0. 1mL,；V 樣總：加入提取液體積， 1mL,；W：樣品質(zhì)量,，g；Cpr：蛋白濃度,，mg/mL

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