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上海源葉生物科技有限公司
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瓊脂免疫擴散試驗
2012-8-4 閱讀(728)
（一）材料與試劑
1．瓊脂粉
2．平皿
3．打孔器
4．生理鹽水或其他緩沖液,，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐,。
（二）操作方法
1．稱取一定量的瓊脂粉,，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液,，水浴煮沸融化20min,。
2．將融化的瓊脂倒入平皿內(nèi),，使厚度2mm～3mm,。自然冷卻。
3．根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑,，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔,。也可直接用組合打孔器打孔?，F(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。
4．挑出孔內(nèi)瓊脂,，注意不要挑破孔緣,。
5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底,，以免加樣后液體從孔底滲漏,。
6．以毛細滴管吸取樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡,，以加滿為度,。加少了，影響反應(yīng)程度,，加多了,，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果,。
7．加畢后,，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來,，置濕盤中,，37℃自由擴散24h～48h。
（三）結(jié)果判定
1．用以檢測抗原或比較抗原差異時,，將抗血清置中心孔,，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶*融合,，證明為同種抗原,；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇,；若二條沉淀線相互交叉,，說明二者抗原*不同。
2．用做血清流行病學(xué)調(diào)查時,，將標(biāo)準(zhǔn)抗原置中心孔,，周圍1、3,、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,，2、4,、6孔分別加待檢血清,。待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶*融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶*交叉者判為陰性,。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶,，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時，兩端均內(nèi)向有所彎曲者判弱陽性,。若僅一端有所彎曲,，另一端仍為直線者,，判為可疑，需重檢,。重檢時,，可加大檢樣的量。
檢樣孔無沉淀帶,，但兩側(cè)陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊,、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過大,，致使沉淀帶溶解,，可將樣品稀釋后重檢。
3．用以檢測的抗血清的效價時,，將抗原置中心孔,，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶的血清zui高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴效價,。
（四）注意事項
1．不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出,、孔型不規(guī)則、邊緣開裂,、孔底滲漏,、孵育時沒放水平、擴散時瓊脂變干燥,、溫度過高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑導(dǎo)致細菌污染等所致,。
2．抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關(guān),。如抗原過多,，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚，反之亦然,?？捎貌煌♂尪鹊姆磻?yīng)液試驗后調(diào)節(jié)。
