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前言簡介
細胞因子誘導(dǎo)中性粒細胞化學(xué)趨化因子1（CINC-1）zui初是通過白介素1β刺激大鼠腎上皮細胞（NRK-52E）純化提取的.1989年時,富山醫(yī)科藥科大學(xué)的Watanabe團隊鑒別出了大鼠CINC-1的氨基酸序列.CINC-1是CXC趨化因子亞族的一員.另外其它幾種大鼠CXC趨化因子（CINC-2α, CINC-2β, CINC-3/MIP-2）的序列也被鑒別出來,大約有63 - 67%的氨基酸序列與CINC-1的相同.此外, GROα, GROβ與GROγ也分別有68%, 71%,69%與CINC-1序列一致.這表明CINCs是人GROs的大鼠相似物.
原理
此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與樣品中大鼠GRO/CINC-1的量成正比.

檢測范圍
4.69 ~ 300 pg/mL

預(yù)期用途

■此IBL試劑盒能用于大鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中GRO/CINC-1的定量檢測

■重組和天然的大鼠GRO/CINC-1都可以檢測.

試劑盒成分
1 預(yù)包被板: 抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標記抗體:
（30倍濃縮）HRP標記抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標準品: 重組大鼠GRO/CINC-1 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液:
（40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1


操作說明
1實驗所需器材（但試劑盒沒有提供）
酶標儀（450nm） 微移液管及其吸嘴
量筒及燒杯 蒸餾水
冰箱（4°C） 坐標紙（log/log）
吸水紙 試管（用于標準品稀釋）
溫育箱（37°C ± 1°C）
洗瓶（用于洗板）
一次性試劑管（用于濃縮酶標記抗體和顯色劑）
2準備

洗滌液的準備
試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL蒸餾水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.

酶標記抗體的準備
試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板（8孔）,就需800 μL.的標記抗體.就用870 μL的標記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗
剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C

標準品的準備
加0.5 mL的蒸餾水到瓶裝標準品,制成濃度為600 pg/mL大鼠GRO/CINC-1標準品液

標準品的稀釋
準備8支試管,并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1 300 pg/mL
試管2 150 pg/mL
試管3 75 pg/ mL
試管4 37.5 pg/mL
試管5 18.75 pg/mL
試管6 9.38 pg/mL
試管7 4.69pg/mL
試管8 0 pg/mL（樣品空白對照）
吸取230ul的標準品液于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻,，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋,，第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照

樣品稀釋
樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋
如果樣品中大鼠GRO/CINC-1的濃度范圍一無所知的話,預(yù)先準備幾個不同稀釋梯度的樣品液來確定*的檢測濃度.


3實驗步驟
使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫,，大約30min,，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無改變,，標準曲線和樣品檢測必須同時進行.


試劑 待檢測樣品 標準品 樣品空白 試劑空白
檢測樣品100ul 稀釋標準品（1-7管）100ul EIA緩沖液（第8管）100ul EIA緩沖液100ul
蓋板,，于37°C下溫育1小時
洗板7次
酶標抗體 100ul 100ul 100ul -
蓋板，于37°C下溫育30min
洗板9次
顯色劑 100ul 100ul 100ul 100ul
室溫避光溫育30min
終止液 100ul 100ul 100ul 100ul
加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值
1）設(shè)試劑空白對照,，并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2） 確定好樣品空白對照孔,，檢測樣品孔和標準品孔，分別將100ul樣品對照品（8號管）,、檢測樣品和稀釋好的標準品（1-7號管）加入到相應(yīng)的微孔中,。
3）蓋板，37°C下溫育1小時
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應(yīng)液
重復(fù)洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動洗板機洗板,先自動洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5）除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6）蓋板,，37°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8） 用一次性試管取所需量的顯色劑,，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min,，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）每孔各加100ul終止液,，溶液顏色會變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標儀450nm處讀取結(jié)果


特別注意

收集樣品后即盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
建議樣品和標準品做雙份檢測
保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結(jié)果
只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果
在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實驗結(jié)果

結(jié)果計算
所有實驗數(shù)據(jù)（包括標準品,檢測樣品的OD值）,都應(yīng)減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應(yīng)的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
標準曲線示范

上圖所示典型標準曲線僅用于演示示范,不能用于試驗數(shù)據(jù)的獲取.每次實驗都應(yīng)建立其標準曲線.

常規(guī)事項
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質(zhì).使用時,避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現(xiàn)沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.

存儲與有效期
存儲條件:2 - 8°C