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上海源葉生物科技有限公司
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免疫熒光標記樣品
2012-2-25 閱讀(932)
用于流式細胞儀檢測的常用熒光素有FITC,、TRITC,、Cy3、Cy5,，PE和PI,，在以上各種熒光染料中，PE熒光zui強,，適用于弱表達抗原,；FITC*，適用于強表達抗原,，適用范圍廣,。
1．直接免疫熒光標記法 取一定量的細胞懸液（濃度約l×l06個／m1），直接加入熒光素標記抗體進行免疫反應(yīng)（如做雙重標記或多重標記染色,，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入）,。4℃孵育15～30分鐘后，用l／15mol／LPBS（pH 7．2～7．4）洗l～2次,，加入緩沖液重懸,，上機檢測。
本方法操作簡便,，結(jié)果準確,，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定,。雖然直接熒光抗體標記試劑成本較高,。但減少了間接標記法中較強的非特異熒光干擾，因此更適用于臨床標本的檢測,。
2．間接免疫熒光標記法 取一定量的細胞懸液（濃度約5×106個／m1）,，加入特異性*抗體，4℃孵育15～30分鐘,，待反應(yīng)*后用磷酸緩沖液洗去未結(jié)合抗體,，吸盡殘留液體，再加入熒光標記第二抗體,，4~C孵育30分鐘,，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物,，洗滌后即可上機檢測。注意：在整個熒光標記過程中均需參考免疫熒光細胞化學間接法染色程序,，尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封閉,，以減少非特異性反應(yīng)。如果對于未經(jīng)固定的細胞需使用0．3％TritonX-100為細胞膜打孔,，以保證抗體能夠進入細胞內(nèi),。
此法費用較低，二抗應(yīng)用廣泛,，多用于科研樣品檢測,。但是，由于非特異性熒光背景較強,，
影響實驗結(jié)果,，在樣品制備時應(yīng)加人陰性或陽性對照。另外,，由于間接法步驟較多,，尤其是經(jīng)過多次洗滌，均可使細胞數(shù)量驟減,，因此,，在加入*抗體前細胞懸液的細胞濃度約5×10‘個／ml，上機檢測前不少于1×106個／ml即可,，此法不適用測定細胞數(shù)較少的樣品,。
3．熒光標記中的注意事項
（1）為減少非特異性干擾，熒光標記物用前應(yīng)用0．22um濾膜過濾或高速離心5分鐘,，以除去顆?；虺猎?/div>
（2）細胞樣品的制備,、染色及保存均應(yīng)該盡量保持新鮮,，防止分解代謝引起的表面抗原消失及細胞死亡，可以通過加入營養(yǎng)培養(yǎng)基或低濃度血清以及4~0或冰浴中操作來解決,。
（3）細胞或低比例細胞亞群分析時，為保證準確,，應(yīng)排除死細胞,。
（4）熒光標記抗體濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高,，會使非特異性結(jié)合增加,。在使用一抗之前，將樣品與過量的牛血清白蛋白（BSA）或來源于同一種屬的正常血清一起孵育,，以阻斷一抗和細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)非特異性作用,。在使用一抗之后,，將樣品、與二抗相同種屬的5％～10％正常血清和二抗一起孵育,，以減少二抗與一抗,、細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的非特異相互作用。如果使用含有與一抗或二抗種屬相同的血清液體稀釋抗體,，便可以省略此步驟,。
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溫馨提示：為規(guī)避購買風險,，建議您在購買產(chǎn)品前務(wù)必確認供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。
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