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上海源葉生物科技有限公司
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流式細(xì)胞術(shù)的常用樣品制備方法
2012-2-25 閱讀(646)
流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)檢測對象是單細(xì)胞懸液，因此，在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中欲對待測樣品細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),，也需把樣品制備成細(xì)胞懸液,，并要求被檢細(xì)胞大小為0．2～80pm，每個(gè)樣品中至少有20 000個(gè)細(xì)胞,，細(xì)胞濃度為105～107個(gè)／ml。制備成的單細(xì)胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標(biāo)記即可上機(jī)檢測,。
1．單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備
（1）棄去培養(yǎng)細(xì)胞（對數(shù)生長期）中的舊培養(yǎng)液,，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察,，見細(xì)胞稍變圓時(shí),，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶,，靜置消化2～3分鐘,，待細(xì)胞逐漸變白，有脫落趨勢時(shí),，立即豎立培養(yǎng)瓶,，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶,；
（2）加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液,，用吸管反復(fù)吹打，使其分散為單個(gè)細(xì)胞懸液,，移人離心管中,；
（3）離心,，去掉上清液，加入約0．5mlPBS液,，用振蕩器使細(xì)胞分散,；
（4）用細(xì)滴管或注射器將細(xì)胞迅速注入4℃ 70％乙醇中，保存于4℃冰箱中備用,。
2．實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備
（1）機(jī)械法
1）用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織,；
2）將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿；
3）用吸管或注射器抽吸細(xì)胞懸液,，以分散細(xì)胞,；
將細(xì)胞懸液在尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)上過濾，濾出的細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用,。
（2）酶處理法 此法是實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的主要方法,。由于不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類,。此外,，乙二胺四乙酸（EDTA）能結(jié)合組織中的二價(jià)鈣離子和鎂離子，而二價(jià)鈣離子和鎂離子有維持細(xì)胞表面完整性和維持細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,，因此,，幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實(shí)體組織，提高細(xì)胞產(chǎn)出效率,。下面僅介紹組織消化的一般過程,，對于每種組織消化時(shí)所用的具體步驟需參考該組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化方法,。
1）將組織剪成l～2mm3左右的小塊,。
2）用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,，如胚胎,、上皮、肝,、腎等組織,。胰蛋白酶工作濃度一般為0．1％～0．5％。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0．25％膠原酶,，膠原酶對組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強(qiáng),，它僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細(xì)胞影響不大。膠原酶常用劑量為0．1～0．3ug／m1,。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織,，需每隔一定時(shí)間搖動一次。消化時(shí)間的長短依組織類型而定,，一般來說,，胰蛋白酶需作用20～60分鐘,，膠原酶需4～48小時(shí)。在消化過程中,，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀,，經(jīng)搖動即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察,，可見分散的單個(gè)細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán),，可認(rèn)為組織已消化充分。
3）消化完畢后,，將細(xì)胞懸液通過100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過,，以除掉未充分消化的組織。
4）已過濾的細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000rpm低速離心5～10分鐘后,，棄上清液,，加PBS液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液,，細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用,。
3．石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備 外科手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，往往已進(jìn)行石蠟包埋處理,，如果再制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞分析,，需將石蠟包埋組織進(jìn)行以下步驟的處理：
（1）將石蠟包埋的組織塊切成30／xm厚的切片，盡可能除去切片中石蠟成分,；
（2）將切片置于離心管中,，用二甲苯脫蠟2次，10分鐘／次,；
（3）蒸餾水洗2次后,，加入lml l％胃蛋白酶溶液中（pH 1．5），37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘,；
（4）離心,，所獲得的細(xì)胞沉淀可進(jìn)行染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。
