我們知道,，過去十年，圖像獲取和分析的自動化為細胞生物學(xué)的發(fā)展鋪平了道路,。一種更加可靠且高產(chǎn)的方法——高內(nèi)涵分析（High Content Analysis,，簡稱HCA）應(yīng)運而生。

在這十幾年的發(fā)展過程中,，市場上出現(xiàn)了很多高內(nèi)涵儀器，這些儀器可以分為三大類：寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵,、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵,。

各種類型的高內(nèi)涵儀器舉例

激光掃描型高內(nèi)涵是以激光作為熒光光源，用PMT采集光信號,，通過預(yù)設(shè)間距點掃描獲得數(shù)據(jù),，沒有成像的過程，速度快是其zui大的優(yōu)勢,。分辨率不高,，只能提供虛擬圖像是這類儀器的局限性，X軸的分辨率是以預(yù)設(shè)的間隔（0.5,、1.0,、1.5、2.0,、2.5或5 um）設(shè)定的,，而Y軸是用戶自行設(shè)定的，一般在1到10 um,。由于不是基于圖像的分析,，分析軟件相對簡單，適合于比較成熟簡單的細胞學(xué)實驗,。所以被很多藥物研發(fā)企業(yè)作為初篩平臺,。

基礎(chǔ)研究的實驗設(shè)計相對復(fù)雜，很多時候需要在亞細胞水平對細胞內(nèi)的微細結(jié)構(gòu)清晰成像,，檢測的指標也復(fù)雜多樣,，需要有非常強大的圖像分析軟件來設(shè)定，所以顯微鏡型的高內(nèi)涵更適合科學(xué)研究的需要,，藥物研發(fā)機構(gòu)復(fù)雜的篩選實驗也會考慮使用顯微鏡型高內(nèi)涵儀器,。

如何選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器，主要考慮三個方面：

1,、成像速度

高內(nèi)涵儀器是在顯微鏡的基礎(chǔ)上搭建的高速顯微成像的平臺,，從所得圖像中抽出一張和普通顯微鏡拍攝的圖像沒有區(qū)別，也就是說,，寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是寬場熒光顯微圖像,，共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是共聚焦質(zhì)量的圖像,。

高內(nèi)涵儀器和普通顯微鏡zui本質(zhì)的區(qū)別在于成像速度極大提高，如果每個孔取一個視野,，雙色熒光,，Hoechst染細胞核，EGFP標記細胞器,，硬件自動聚焦,，GE Healthcare的IN Cell 2000可以在約3分鐘內(nèi)對整塊96孔板成像，在短短幾分鐘內(nèi)得到將近200張照片,。IN Cell 2000能夠高速成像是因為：1）明亮的光源,，和顯微鏡以液體光導(dǎo)纖維相連，光的傳輸效率高,，顯著縮短曝光時間,；2）大芯片CCD相機可選擇，成像視野約是標準芯片相機成像視野的四倍,，大芯片CCD相機一個視野就有可能捕捉到足夠的細胞用于統(tǒng)計學(xué)分析,，節(jié)省很多時間；3）在線細胞計數(shù)功能：微孔板各個孔中細胞的生長狀態(tài)可能會不同,，在線細胞計數(shù)針對不同的孔自動調(diào)整拍攝視野數(shù)量,，整體縮短實驗時間；4）自動聚焦：是提高成像速度的關(guān)鍵,，IN Cell 2000提供基于激光的硬件自動聚焦和基于圖像對比度的軟件自動聚焦,，二者可結(jié)合使用。

需要注意的是,，寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快,，共聚焦型高內(nèi)涵比共聚焦顯微鏡成像速度快，而共聚焦型高內(nèi)涵未必比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快,，所以用戶需要根據(jù)實驗的需要來選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器,。IN Cell 2000雖然不是共聚焦高內(nèi)涵，但其*的去卷積圖像復(fù)原功能可以顯著提高圖像的對比度和分辨率,，提供可以和共聚焦圖像媲美的高質(zhì)量的圖像,。

2、圖像質(zhì)量和成像速度之間的平衡

科研用戶既希望成像速度快,，又希望圖像質(zhì)量好,，可以考慮GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光為光源的可變光闌線掃描共聚焦高內(nèi)涵儀器,，擁有的光學(xué)系統(tǒng),，成像*可調(diào)：光闌*打開時成像速度zui快，*共聚焦模式去除背景zui有效,，光闌打開的程度在1-3 AU之間可調(diào),，可以針對不同的需求調(diào)節(jié)共聚焦程度達到成像速度和圖像質(zhì)量的優(yōu)化組合,。IN Cell 6000感光成像采用550萬像素新一代sCMOS相機，噪音比CCD相機低五倍,，超高靈敏度并縮短曝光時間,，比標準相機的視野大四倍。

3,、圖像分析軟件

科研用戶檢測的指標復(fù)雜多樣,，除了基本的模塊式分析工具，還需要有更強大的分析軟件允許用戶自主定義分析程序,。GE Healthcare的高內(nèi)涵平臺除了基本的分析工具,，還提供IN Cell Developer Toolbox 客戶自定義分析軟件，可以分析各種實驗的圖像結(jié)果,。針對特定的實驗，用戶使用一系列的圖像分析工具來編寫自己的分析程序,，包括：區(qū)分（segmentation）工具,，圖像處理工具，自定義測量值,，宏子程序等,。Developer Toolbox曾獲得2006年*生物圖像分析軟件獎（美國科學(xué)雜志Scientific Computing頒發(fā)）。

Spotfire是一款用于科學(xué)數(shù)據(jù)分析的可視化分析平臺,，其zui大的特點是通過多種動態(tài)的圖形（點圖,、線圖、柱狀圖,、餅狀圖,、熱圖等）和篩選條件，快速對大量的數(shù)據(jù)進行分析和處理,，并可以做出報告或與他人分享結(jié)果,，做出決策。支持多種客戶端界面和Web界面的訪問和顯示,。IN Cell 圖像分析軟件內(nèi)嵌和Spotfire DecisionSite Basic軟件連接的圖標,，輕松使用數(shù)據(jù)可視化分析工具。

IN Cell Miner HCM數(shù)據(jù)管理軟件以經(jīng)過驗證的 EMC Documentum 軟件為基礎(chǔ),，可以方便地注釋,、建檔、檢索,、存儲高內(nèi)涵圖像和數(shù)據(jù),。研究機構(gòu)的所有使用者可以分享和比較數(shù)據(jù)，zui大限度地挖掘和實現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的價值,?？焖僦谱鼍赖臄?shù)據(jù)圖,，用于工作展示、技術(shù)交流和文章發(fā)表,。

IN Cell 2000和IN Cell 6000都可以對玻片成像,，透射光成像有三種模式可選（明場、相差和微分干涉）,，可以提供溫度,、濕度和CO2用于活細胞的長時間觀察，有自動移液加樣模塊用于動力學(xué)分析,。

此外,，IN Cell平臺du有的三種功能為高內(nèi)涵實驗提供更多的幫助：1）預(yù)覽掃描功能：可以在任何放大倍數(shù)下對任意區(qū)域進行預(yù)覽掃描，幫助了解樣品概況,，確定感興趣的區(qū)域和視野的分布,，如果需要，可以對整個微孔板或者整張蓋玻片進行預(yù)覽掃描,。2）整孔成像功能：低倍物鏡和大芯片CCD結(jié)合使用時,，一張照片就可以快速捕捉整孔細胞、大面積組織和小生物體的圖像,，在用高倍物鏡成像前可以快速確定感興趣區(qū)域的位置,，也不會漏掉偶發(fā)事件。3）手動顯微鏡模式：當前視野全屏顯示,，鼠標移動到四周可以顯示4組成像工具,，分辨率更高，調(diào)整成像參數(shù)后,，可以實時觀察效果,。