如何選擇凝膠
做分離純化工作的人都知道,，選擇合適的填料是至關(guān)重要的,。
1.測定------分子量,、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量,、PI等都不清楚時,，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測定未知蛋白的分子量,。用少量離子交換介質(zhì)在多個含不同PH緩沖液的試管中,，可簡易地測出PI，并選擇純化用緩沖液的*PH,。
2.選擇------層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解,，可嘗試幾種不同的純化方法：
一] 使用zui通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose,、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份,。
二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標蛋白的底物,、受體等自制親和介質(zhì),，再用以結(jié)合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品,。
三] 體積大的樣品,，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品,，可再用疏水層析純化,。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理,，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析,。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
3.純化------大量粗品
處理大量原液時,，為避免堵塞柱子,，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL,、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì),。擴張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白,。將離心,、超濾、初純化結(jié)合為一,。提高回收率,，縮短純化周期。
4.純化------硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品,，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下,，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽,。疏水層析是較新技術(shù),，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中,。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇介質(zhì)及*的純化條件,。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純水-----糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白,、花生,、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基,，很適合用作分離糖化細胞膜組份,、細胞、甚至亞細胞細胞器,，純化糖蛋白等,。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì),，專為俘獲整個細胞或大復(fù)合物,，如膜囊等。
6.純化------膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性,。離子性去污劑應(yīng)選用與目標蛋白相反電荷者,，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質(zhì)，籍此除去去污劑,。非離子性去污劑可以疏水層析除去,。
7.純化------單抗、抗原
*單抗多為IgG,。來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液,。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等,。Mabselect,、Protein G和Protein A對IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG,。血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理,，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白A介質(zhì)Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性,，基團脫落更少,。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除,。
*疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG,。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
*純化IgG抗原zui有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG,，再進一步獲取IgG抗原,。
*HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達5mg IgM,。HiTrap IgY是專門用來純化IgY,，結(jié)合量達100mg純IgY。
8.純化------重組蛋白
重組蛋白在設(shè)計,、構(gòu)建時應(yīng)已融入純化構(gòu)想,。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產(chǎn)物，擴張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離,。Amersham biosciences提供三個快速表達,、一步純化的融合系統(tǒng)。
一] GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達,，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化,，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2． 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達,，以IgG Sepharose 6 FF純化,。
二] 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白,。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法,。
9.純化------包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化,。變性純化后的蛋白需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象,。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性,。一般包涵體蛋白樣品的純度越高,，復(fù)性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品,，并可以1MnaOH重生,。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高,。
10.包涵體蛋白固相復(fù)性
*近年許多文獻報導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上,，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后,，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性,，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過程中蛋白質(zhì)聚體的形成,，所以復(fù)性得率更高,，而且無需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時間及提高回收率,。
*固相復(fù)性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白,；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用,，比一般試劑盒更方便,、耐用。
11.純化------中草藥有效成分
中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜,。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用,，有效成份多較為親水，包括生物堿,、黃酮,、蒽醌、皂甙,、有機酸,、多糖、肽和蛋白質(zhì),。靈活及綜合性地利用多種層析方法,。如離子交換、分子篩,、反相層析,，更容易分離到單一活性成分,。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能,，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來,，二糖甙其次,，單糖甙隨后，zui后是甙元,。Sephadex LH-20可使用水,、醇、丙酮,、氯仿等各種試劑,，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿,、甙,、黃酮、醌類,、內(nèi)脂,、萜類、甾類等。
*生物堿在酸性緩沖液中帶正電,，成為鹽,，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反,，黃酮,、蒽醌、皂甙,、有機酸等可溶于偏堿的緩沖液中,，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex,，Sephacryl,。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率,，可選擇新一代的Superdex,。一般植物可能含水溶性、酸溶性,、堿溶性多種多糖,。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外,，多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質(zhì),，傳統(tǒng)Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復(fù)數(shù)十次。陰陽離子交換法可以一,、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì),。SOURCE5、15,、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測,、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜,，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ,，并可用1M NaOH，1M HCL清洗,、再生,。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長,。
12.純化------肽類
肽類的來源有天然萃取,，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解,，但可從有機溶劑或促溶劑中復(fù)性,，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC,、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads,、Monobeads作純化,。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖,。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG,。
13.純化------核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究,。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA,、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子,，和質(zhì)粒DNA一樣,，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白,，再配合離子交換如Mono Q,、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化------寡核苷酸
寡酸苷酸多應(yīng)用在反義（anti-sense）DNA,、RNA測序,、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物,，并避免凝集和保護基的脫落,。載量大大高過反相層析，可用做大量制備,。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除,。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex G10,，G15,，G25,，G50等去除小分子,，效率高，處理量可達床體積30%,。只需在進樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液,，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接,。由于只是去除小分子,，柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數(shù)分鐘至半小時完成,。Sephadex G25系列介質(zhì)專為蛋白質(zhì)脫鹽而設(shè)計,，預(yù)裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作,。HiPrep Desalting（26ml）可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化
使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharose 4FF純化疫苗,，去除培養(yǎng)基中的雜蛋白,，處理量可大于床體積10%。柱高一般40-70cm,，整個過程約半至一小時,。目前使用此法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬,、出血熱,、流感、肺結(jié)核,、小兒麻痹疫苗等,。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等,。
17.抗生素聚合物分析
中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產(chǎn)品的白分比,，規(guī)定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質(zhì)粒
Q Sepharose XL,，SOURCE 15Q,，STREAMLINE Q，Sephacryl S500,，Plasmidselect
在下游純化中,可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時,去除各種污染物,。
1.去除——內(nèi)毒素
內(nèi)毒素又稱熱原。含脂肪A,、糖類和蛋白,，是帶負電的復(fù)合大分子。
內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強的疏水性,。但在高鹽下會凝集,，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結(jié)合目標蛋白的介質(zhì)而去除內(nèi)毒素,。
內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結(jié)合,。可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除,。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL,，PMB，自動成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素,。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體,，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度,，令區(qū)帶擴張,，反壓增加,，降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴格限制,。
胞內(nèi)表達蛋白的核酸問題尤其嚴重,。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質(zhì)如STREAMLINESP,，SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL結(jié)合目標蛋白,，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離,疏水層析介質(zhì)很適合用來結(jié)合目標蛋白,在純化蛋白的同時去除核酸,。
利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了,。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原,應(yīng)盡量減除。結(jié)合不同層析技術(shù),，使用注射用水,，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加,。
病毒大都有脂外殼,。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理,，使病毒失活,，如Triton和Tween。再用適當?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標蛋白,，去除S/D,。
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質(zhì)Superdex及多種吸附性介質(zhì),，SOURCE都是很好的精細純化介質(zhì),可去除多種微量污染物,。
