貨號:YJ2445                                                     規(guī)格：25管/24樣

線粒體復合體Ⅲ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

線粒體復合體Ⅲ（EC1.10.2.2） 又稱 CoQ-細胞色素C還原酶，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責把還原型 CoQ 的氫傳遞給細胞色素C,，生成還原型細胞色素C,。

測定原理

與氧化型細胞色素C不同，還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收,，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復合體Ⅲ酶活性,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機,、水浴鍋,、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑三：0.5 mL×1 支,，-20℃保存；

試劑四：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存,；

試劑六：液體 2.5mL×1 瓶,，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2、將勻漿600g,，4℃離心 5min,。

3,、棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心10min,。

4,、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅲ（此步可選

做）,。

5,、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復30次），用于復合體Ⅲ酶活性測定,。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 550nm,，蒸餾水調零,。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉移到試劑四中混合溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或

25℃（其它物種）孵育 5min,；用不完的試劑 4℃可保存一周；

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本,、100μL 試劑六和 800μL 工作液,，立即混勻，

記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,，計算 ΔA=A2-A1,。

復合體Ⅲ活力單位的計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位,。

復合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=124×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，9.4×10^-4 L,；ε：細胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴L/mol/cm,；

d：比色皿光徑,，1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.04 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；

T：反應時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,； W：樣本質量,，g；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬,。

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