貨號:YJ2445                                                     規(guī)格：25管/24樣

線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

線粒體復(fù)合體Ⅲ（EC1.10.2.2） 又稱 CoQ-細(xì)胞色素C還原酶,，廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,，負(fù)責(zé)把還原型 CoQ 的氫傳遞給細(xì)胞色素C,，生成還原型細(xì)胞色素C,。

測定原理

與氧化型細(xì)胞色素C不同,，還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計,、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶,，-20℃保存,；

試劑三：0.5 mL×1 支，-20℃保存,；

試劑四：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存,；

試劑六：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、將勻漿600g，4℃離心 5min,。

3,、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。

4,、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ（此步可選

做）。

5,、步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次）,，用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測定,。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 550nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前把試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或

25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑 4℃可保存一周,；

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本,、100μL 試劑六和 800μL 工作液，立即混勻,，

記錄 550nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,，計算 ΔA=A2-A1。

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞色素 C 定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)

÷T=124×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，9.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù),，1.91×10⁴L/mol/cm,；

d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；

T：反應(yīng)時間，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL； W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬,。

線粒體膜電位代測報價

Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書

蛋白樣品冰凍干燥技術(shù)

Tris-硼酸電泳緩沖液(5×TBE, RNase free)