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免疫組化ABC法
(一),、儀器設(shè)備
1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐,;
2)水浴鍋
(二),、試劑
1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,,KCl 2.7mmol/L,,Na2HPO4 4.3mmol/L,, KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,,pH6.0,,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g,。
3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,,用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,,用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml,。
5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制,。 b,、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制,。
7)封裱劑:
a,、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;
b,、甘油和TBS(或PBS)配制,。
8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本,;pH7.0~7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本,。
(三)、
SABC法
1)脫蠟、水化,。
2)PBS洗兩次各5分鐘,。
3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,,蒸餾水洗3次,。
4)抗原修復(fù)。
5)PBS洗5分鐘,。
6)滴加正常山羊血清封閉液,,室溫20分鐘。甩去多余液體,。
7)滴加抗小鼠一抗(合適的濃度),室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)
(4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘),。
8)PBS洗三次每次2分鐘。
9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分鐘,。
10)PBC洗3次每次2分鐘,。
11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘,。
12)PBS洗4次每次5分鐘,。
13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
14)蒸餾水洗,。蘇木素復(fù)染2分鐘,、鹽酸酒精分化。
15)脫水,、透明,、封片、鏡檢,。
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