禽腺病毒I群(FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽腺病毒I群 (FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

禽腺病毒感染主要感染家禽,，一旦感染容易通過家禽消化道及呼吸道進行擴散,，引起家禽暴發(fā)流行性疾病,，引起病雞出現(xiàn)精神不振,、排稀糞便,，心包積液滲出,、肝脹腫脹出血,，造成家禽死亡，禽腺病毒I群為常見型,，包括A\B\C\D\E型,。本試劑盒適用于檢測呼吸道分泌物棉拭子（感染I群禽腺病毒的雞、火雞,、鵝,、鵪鶉）、卵巢,、輸卵管,、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織,、泄殖腔拭子（感染I群禽腺病毒的雞,、鴨）等樣本中的禽腺病毒感染的輔助診斷，其檢測結果僅供參考,。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術,，選用3套引物探針組合，包含禽腺病毒I群的A型,C型,E型的特異性基因,，分別設計1對特異性引物,，并結合1條特異性探針，用熒光PCR技術對禽腺病毒的核酸進行體外擴增檢測,，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷,。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存,、運輸、反復凍融少于7次,，有效期12個月,。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P,、LightCycler,、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀,。

【標本采集】

    病死禽取卵巢,、輸卵管,、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織,；活雞取呼吸道拭子或泄殖腔拭子,，放于1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸,，嚴禁反復凍融,。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min,，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中,；泄殖腔拭子直接取100μL進行DNA提取。

1.2 DNA提取

為了使實驗結果穩(wěn)定,、有效,、可靠，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進行提取,，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作,。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照,；樣品每滿7份,，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻，短暫離心,。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi),；

4.2 設置好通道、樣品信息,，反應體系設置為25μL,；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測禽腺病毒A型，淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請勿選擇ROX參比熒光,。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析,，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果,。

5.2 結果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,。

可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0,，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性,，否則為陰性,。

陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集,、處理,、運送以及保存質(zhì)量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結果,；

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,，會導致假陽性結果,；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組,，會導致假陰性結果,；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果,；

? 試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果,；

? 本檢測結果僅供參考,，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,，且Ct值≤30；

以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效,。

8. 性能指標

（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上,。最低檢測限不低于1000copies/ml,。

（2）特異性：100%,。

（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行,；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，完全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存,；

? 反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

? 樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行,，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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