山羊痘病毒(GTPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：山羊痘病毒(GTPV)核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測羊皮膚和呼吸道等樣本中的山羊痘病毒，適用于山羊痘病毒病感染的輔助診斷,，其檢測結(jié)果僅供參考,。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設(shè)計一對山羊痘病毒特異性引物,，各結(jié)合一條特異性探針,，用熒光PCR技術(shù)對山羊痘病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存,、運輸,、反復(fù)凍融少于7次，有效期12個月,。

【適用儀器】

ABI ,、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

    采集疑似患病羊的皮膚組織樣本或呼吸道樣本,。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月,，標本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸,，嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,，8000rpm離心2min,，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；分泌液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中,。

1.2  DNA提取

為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定,、有效,、可靠，我們建議使用商品化的病毒DNA 提取試劑盒進行提取,，嚴格按照對應(yīng)試劑盒說明書進行操作,。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照,；樣品每滿7份,，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻，短暫離心,。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL,；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM,，淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請勿選擇ROX參比熒光

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果,。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,。

可疑：檢測通道35<Ct值<38.0,，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤38.0和典型擴增曲線者判為陽性,，否則為陰性,。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理,、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

? 陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

? 病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

? 不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,，且Ct值≤30,；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效,。

8. 性能指標

（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%,，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml,。

（2）特異性：100%,。

（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行,；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

? 樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行,，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

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