β-葡萄糖苷酶（β-GC)活性檢測試劑盒說明書

注意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,。

微量法

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存,；臨用前每瓶加入 12mL 雙蒸水,，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存,。

試劑二：液體 15mL×1 瓶,，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶,，4℃保存,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，5μmol/mL 的對硝基苯酚溶液,。

產(chǎn)品說明：

β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，催化β-糖苷鍵水解,，具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC 負責(zé)進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖,；β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體,，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味,；β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷,，釋放 HCN，從而防止昆蟲取食,。

β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性,。

試驗中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水

操作步驟：

一,、粗酶液提取：

1,、細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照每 1000 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,，15000g,， 4℃，離心 20min,，取上清,，置冰上待測。

2,、組織的處理：稱取約 0.2g 組織,，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；15000g,，4℃，離心 20min,，取上清,，置冰上待測。

3,、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取 100μL 標(biāo)準(zhǔn)液,，加入到 400μL 試劑三中，得到 1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液,，十倍稀釋到 100nmol/mL,，用蒸餾水倍比稀釋：50、25,、12.5,、6.25nmol/mL。100,、50,、25、12.5,、6.25,、0nmol/mL 做標(biāo)準(zhǔn)液。

二,、測定步驟

1.分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零,。

2.加樣表

試劑名稱（μL）測定管對照管標(biāo)準(zhǔn)管

試劑一120

試劑二150150

樣本3030

充分混勻,，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，立即放入沸水浴中煮沸 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻,，8000g，4℃,，離心 5min,，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 2min 后,，400nm 處測定吸光值 A,，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。三,、β-GC 活力計算：

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（減去濃度為 0 標(biāo)準(zhǔn)管的 OD 值，x）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA（x）帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）,。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織在每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.3mL,；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1mL；W：樣品鮮重,，g,；1000：細胞或細菌總數(shù)，1000 萬,；T：反應(yīng)時間,，0.5h。

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