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碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,CA)試劑盒說明書

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碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,,CA)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase ,CA)是一種含鋅金屬酶,,迄今在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少有  11種同工酶,,它們的結(jié)構(gòu)、分布,、性質(zhì)各異,, 多與各種上皮細(xì)胞泌H-和碳酸氫鹽有關(guān),通  過催化CO2水化反應(yīng)及某些脂,、醛類水化反應(yīng),, 參與多種離子交換 ,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),。 測定原理:

碳酸酐酶具有酯酶活性,, 可催化乙酸對硝基苯酯反應(yīng)生成對硝基苯酚, 通過檢測 405nm 處 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性,。

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、 96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 50mL×2 瓶,, 4℃保存;

試劑一:液體 20mL×1 瓶,, 4℃保存,;

試劑二: 粉劑×1 瓶,, -20℃避光保存; 臨用前加入 5mL 試劑三,,充分溶解待用, 用不完的 試劑繼續(xù)-20℃避光保存,。

試劑三:液體 6mL×1 瓶, 4℃保存,。

樣品測定的準(zhǔn)備:

1,、細(xì)菌或細(xì)胞的處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),,離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 (104 個): 提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),, 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,,功率 20%或 200W,超聲 3S,,間隔 10S,,重復(fù)

30 次) ;8000g ,,4℃離心 10min,,取上清, 置冰上待測,。

2,、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,,加入 1mL 提取液) ,,冰浴中勻漿。 8000g  ,,4℃離心 10min,,取上清,, 置冰上待測。 測定步驟

1 ,、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,,調(diào)節(jié)波長至 405nm。

2 ,、試劑一,、試劑二提前 25℃預(yù)熱 10min。

3 ,、取 96 孔板,,依次加入 20μL 樣本上清, 140μL 試劑一,, 最后加入 40μL 試劑二,。立刻混 勻, 測定 405nm 下 3min 處吸光值 A1  與 6min 處吸光值 A2 ,,ΔA=A2-A1


CA 活力計算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 1.0424x + 0.001,,R2 = 0.9994;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),, y 為吸光值,。

1、按照蛋白濃度計算

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位,。

CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(V 樣×Cpr)÷T×1000 =319.77×(ΔA-0.001) ÷Cpr

2,、按樣本鮮重計算

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對硝基酚定義為一個酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000



=319.77×(ΔA-0.001) ÷W

3,、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義: 每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對硝基酚定義為一個酶活力單位,。

CA 活性(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 =0.639×(ΔA-0.001)

V 樣: 加入樣本體積: 0.02mL;V 樣總: 加入提取液體積,, 1 mL,;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度, mg/mL,;W:樣本質(zhì)量,, g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),, 500 萬,; T:反應(yīng)時間, 3min,;1000,,μmol 到nmol 的換算系數(shù)。


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