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輔酶 I NAD (H)含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

貨號：BC5190

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL,。-20℃可以保存2周,。

2、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水,，即 2 µmol/mL,。-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說明：

輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式,，在生物氧化中起傳遞氫的作用,。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解,、糖異生,、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD,，使之成為NADH（還原型輔酶I）,。而NADH則會(huì)作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式,，合成 ATP,。NAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝,、能量代謝,、抗細(xì)胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān),。體內(nèi)輔酶I含量降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡,。

分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH，在1-mPMS作用下,，WST-1可與NADH 反應(yīng),，產(chǎn)生水溶性formazan,，在450nm下有特征吸收峰，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH,，進(jìn)一步采用WST-1檢測,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、低溫離心機(jī)、水浴鍋,，研缽/勻漿器,、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、血清（漿）中NAD⁺和NADH的提?。?/span>

NAD⁺的提取：建議取0.1mL血清（血漿）,，加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min，取上清,，冰上待測,。

NADH的提取：建議取0.1mL血清（血漿）,，加入0.5 mL堿性提取液,，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后,，10000g， 4℃離心10min,；取200μL上清液,，加入200μL酸性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min,，取上清，冰上待測,。

2,、組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提?。?/span>建議取0.1g組織質(zhì)量,，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨,，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴冷卻后,，10000g,， 4℃離心10min；取200μL上清液,，加入200μL堿性提取液使之中和,；混勻，10000g 4℃離心 10min,，取上清,，冰上待測。

NADH的提?。?/span>建議取0.1 g組織質(zhì)量,，加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨,，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴冷卻后,，10000g,， 4℃離心10min；取200μL上清液,，加入200μL酸性提取液使之中和,；混勻，10000g 4℃離心 10min,，取上清,，冰上待測。

3,、細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD⁺ 和 NADH 的提?。?/span>

NAD⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),，離心棄上清，建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液,，超聲波破碎（冰浴,，功率200W，超聲3s,，停10s,，重復(fù)30次），煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min，取上清,，冰上待測,。

NADH的提取：建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴,，功率200W,，超聲3s，停10s,，重復(fù)30次）,，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后,，10000g， 4℃離心10min,；取200μL上清液,，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻,，10000g 4℃離心 10min,，取上清，冰上待測,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為0.3125,、0.15625,、0.078、0.039,、0.019,、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。0nmol/mL即為空白管（A_空）,。

3、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為0.625,、0.3125,、0.15625、0.078,、0.039,、0.019、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,。0nmol/mL即為空白管（A_空）,。

4、 稀釋表

5,、 在EP管中按順序加入下列試劑：

混勻,， 450nm下比色，讀取吸光值,，NAD⁺的記為：ΔA_NAD= A₂- A₁,，NADH的記為ΔA_NADH= A₂’- A₁’，NAD標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NAD標(biāo)}= A_標(biāo)-A空白管,。NADH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADH標(biāo)}= A_標(biāo)’-A空白管,。（標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次，每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管）

三,、NAD⁺和NADH含量計(jì)算

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

（1） NAD⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₁,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定代入方程得到x₁（nmol/mL）,。

（2） NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₂,，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₂，ΔA標(biāo)準(zhǔn)）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）,。

2,、NAD⁺和NADH含量計(jì)算

（一）NAD⁺含量計(jì)算

（1） 按液體體積計(jì)算：NAD⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NAD⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計(jì)算NAD⁺含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NAD⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH含量計(jì)算

（1） 按液體體積計(jì)算：NADH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計(jì)算NADH含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NADH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液體積,，1mL,；V血清：血清（漿）體積，0.1mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣

本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬,。

注意事項(xiàng)：

1,、反應(yīng)過程中注意避光。

2,、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。同步修改計(jì)算公式,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. NAD⁺的測定：稱取 0.1g 冬青葉片,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.089=0.024,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.034,，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.34 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取 0.1g 冬青葉片,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.250-0.168=0.082，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.186,，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=1.86 nmol/g 質(zhì)量,。

2. NAD⁺的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.068-0.045=0.019,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.025,，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.25nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.217-0.118=0.099，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.224,，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=2.24 nmol/g 質(zhì)量,。

3. NAD⁺的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.074=0.039,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.059，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.59 nmol/g 質(zhì)量,。

NADH的測定：取0.1mL馬血清,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計(jì)算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.120-0.097=0.023,，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.053,，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=0.53 nmol/g 質(zhì)量。

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