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乙酰乙酸（AcAc）含量檢測試劑盒（WST法）說明書

                                            可見分光光度法

貨號：BC5070

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前取一支加入1.5mL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周,。避免反復(fù)凍融。

2,、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水（約40T）,，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存,，可以保存2周,。避免反復(fù)凍融。

3,、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 乙酰乙酸鋰,。臨用前加入950μL蒸餾水，充分溶解,，即8mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液,。-20℃分裝保存4周。

4,、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一,、試劑二、試劑三按照850:40:10（共900μL,，1T的量）的比例配成工作液,，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略）,，現(xiàn)用現(xiàn)配,，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說明：

乙酰乙酸(AcAc)是酮體的重要成分之一,，約占正常人酮體總量20%,，是脂肪酸通過氧化產(chǎn)生的,是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸。正常含量的乙酰乙酸對人體無害,，糖尿病患者由于糖的利用降低,，或饑餓時由于糖的代謝障礙，大量動用脂肪,，乙酰乙酸的量都會積累,。乙酰乙酸即可轉(zhuǎn)化成丙酮，也可以轉(zhuǎn)化成β-羥丁酸,。

在檢測中,，乙酰乙酸通過偶聯(lián)酶反應(yīng)產(chǎn)生450nm吸收峰的產(chǎn)物,，與存在的乙酰乙酸成比例。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī),、超聲波細(xì)胞破碎儀,、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃,，12000 g離心10 min,，取上清，置冰上待測,。

2,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；12000 g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、血清（漿）：直接測定。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將8mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋0.25,、0.2,、0.15、0.1,、0.05,、0.025、0.0125,、0.00625 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用,。

3、 按下表步驟加樣：

三,、AcAc含量計算

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL）,，以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）,。

2,、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

AcAc含量（μmol/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷108.02×1000=9.258x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

AcAc含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷108.02×1000=9.258x÷W

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算

AcAc含量（μmol/10⁴ cell）=x×V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷108.02×1000=9.258x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

AcAc含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣÷108.02=9.258x

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，100 μL=0.1 mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以10⁴計,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；108.02：乙酰乙酸鋰分子量,，mg/mmol,。

注意事項：

1,、顯色完成后，請在15min之內(nèi)完成檢測,。

2,、如果ΔA測定低于或超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定,。

實驗實例：

1. 取100μL 牛血清按上述步驟進(jìn)行實驗,，用1mL玻璃比色皿測定后進(jìn)行計算ΔA測定=A空白-（A測定-A對照）=1.101-（1.129-0.063）=0.035，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.299x+0.006,，計算x=0.097,。計算

AcAc含量（μmol/mL）=9.258x=0.898μmol/mL

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