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微生物及液體樣本中甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC4990

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取1支加入0.25 mL蒸餾水,，震蕩溶解,；用不完的試劑-20℃分裝保存2周。

2,、 試劑二工作液：根據(jù)試驗所需用量,，按照試劑二（μL）∶蒸餾水（μL）=1∶29比例配成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用,。試劑二工作液當天配制當天用完,。

3、 試劑三：臨用前取1支加入1.5 mL蒸餾水,，震蕩使其充分溶解,。用不完的試劑4℃分裝保存2周。

產(chǎn)品說明：

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中,，是一種將甲醛進行轉(zhuǎn)換的氧化還原酶,。甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD⁺產(chǎn)生 NADH，在 340nm 處的吸光值會增加,，測定340nm處的吸光值變化,，可計算得到甲醛脫氫酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、1 mL石英比色皿,、低溫離心機、恒溫水浴鍋/培養(yǎng)箱,、可調(diào)式移液槍,、超聲波細胞破碎儀、蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照每500萬細菌或細胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3s,，間隔9s，總時間 3 min）,；然后8000 g,，4℃,，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清,，建議重復上述離心步驟）,，置于冰上待測。

血清及液體樣本：直接檢測,，若液體不澄清,，可以離心后取上清測定。

二,、測定步驟

1,、 紫外分光光度計預熱30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 臨用前將試劑一置于37℃預熱20 min,。

3,、在1 mL石英比色皿中依次加入 100 μL 樣本、550 μL試劑一,、250 μL試劑二工作液,、50 μL試劑三、50 μL試

劑四,，立即充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A1,，迅速置于37℃水浴鍋或者培養(yǎng)箱中反應5min，拿出迅速擦干測定5min20s時的吸光值A2,，記錄 340nm 下20s時吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2,。計算ΔA=A2-A1。

三,、酶活性計算

1,、細菌或培養(yǎng)細胞中FDH活力的計算

（1）按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =ΔA×321.54÷N×F

（2）按蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2,、血清（漿）或液體樣本FDH活力的計算

（1）按液體體積計算：

單位的定義：每mL液體樣本中每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T×F =ΔA×321.54×F

（2）按蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

e：NADH 摩爾消光系數(shù),，6220 L/mol/cm；d：石英比色皿光徑,，1cm,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；V反總：酶促反應總體積,，0.001L,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；V樣：加入樣本體積,，0.1 mL；T：反應時間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；N：細胞或細菌總數(shù),，以萬計；F：稀釋倍數(shù),；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹ nmol。

注意事項：

1,、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5,，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù),；如果測定吸光值較低,，建議增加樣本量后再進行測定。

2,、試劑四有毒性,，實驗時請佩戴口罩手套等防護措施。

實驗實例：

1,、 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1 mL提取液,，超聲波破碎細胞（功率300W，超聲3s,，間隔9s,，總時間 3min）,；然后8000 g,，4℃，離心10 min,，取上清按照測定步驟操作,，測定后計算ΔA =A2-A1=0.297-0.039=0.258，按細菌數(shù)量計算酶活得：

FDH酶活（U/g 質(zhì)量）= 321.54×ΔA÷W×F =829.57 U/g,。

2,、 取0.1 mL牛血清按照測定步驟操作，測定后計算ΔA=A2 -A1=0.124-0.087=0.037,，按液體體積計算酶活得：

FDH酶活（U/mL）=ΔA×321.54=11.896 U/mL,。

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