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肌酸含量檢測(cè)試劑盒（酶法）說明書

可見分光光度法

貨號(hào)：BC493

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

試劑一：臨用前每支加入1 mL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃保存,。

試劑二：臨用前每支加入0.2 mL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑分裝后-20℃保存,。

試劑三：臨用前每支加入0.5 mL蒸餾水（100T/48S），充分溶解,。為方便儲(chǔ)存故多給一支,。用不完的試劑分裝后-20℃保存。

試劑四：臨用前根據(jù)試驗(yàn)所需用量,，按照試劑四A液：試劑四B液=1:1,，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg一水肌酸,。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解,，即1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,。臨用前取20μL和80μL蒸餾水混合配制成200μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說明：

肌酸(Creatine)是一種含氮化合物,，自然存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)，能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細(xì)胞提供能量,。肌酸可由精*酸（arginine),、甘*酸（glycine）及甲硫*酸（methionine）三種氨基酸合成，可由人體自行合成,，也可以從食物中攝取,。大約95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式為磷酸肌酸,。肌酸作為一種補(bǔ)充劑主要通過增加肌肉質(zhì)量,，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)能力,。肌酸也被作為神經(jīng)肌肉疾病的一種治療藥被廣泛研究，它可能有助于保護(hù)神經(jīng)和改善細(xì)胞生物功能狀態(tài),。

肌酸酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶,，可將肌酸轉(zhuǎn)化為甘*酸、甲醛,、過氧化氫,，過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物,，在505nm 有特征吸收峰,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、低溫離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,、超聲破碎儀。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)菌,、細(xì)胞樣本的制備：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）: 提取液一體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒,，間隔9秒,，總時(shí)間5 min）；于4℃,，12000 g離心10 min,，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二,，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測(cè)。

2,、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液一體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃,，12000 g離心10 min,，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測(cè),。

3、血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一,，4℃,，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二,，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測(cè),。

二,、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次,。

三,、肌酸含量計(jì)算

1、 計(jì)算公式

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

肌酸含量（μg/mg prot）=C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×V樣÷（V樣×Cpr）×0.879=175.8×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×0.879

=208.76×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

肌酸含量(μg/10⁴ cell) = C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×(V上清+V提取液二)÷(細(xì)胞數(shù)量×V上清÷V提取液一)×0.879

= 208.76×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計(jì)算

肌酸含量(μg/mL) =C標(biāo)×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]×0.879 =2296.39×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，200 μg/mL,；V樣：加入樣本體積，50 μL=0.05mL,；V上清：提取時(shí)上清液體積,，0.8 mL,；V提取液一：加入提取液一體積，1 mL,；V提取液二：加入提取液二體積,，0.15 mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計(jì),；V液體：液體樣本體積，0.1 mL,；0.879：換算系數(shù),，一水肌酸相對(duì)分子質(zhì)量149.15，無水肌酸相對(duì)分子質(zhì)量131.13,，0.879=131.13÷149.15,。

注意事項(xiàng)：

1、 顯色完成后,，請(qǐng)?jiān)?/span>10 min之內(nèi)完成檢測(cè),。

2,、 提取液中含有蛋白沉淀劑,，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測(cè)定。若想要用蛋白濃度計(jì)算肌酐含量需要另取組織或血清（漿）,，即取相同質(zhì)量（體積）的組織（血清（漿））用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液）,，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

3,、 如果測(cè)定吸光值超過標(biāo)準(zhǔn)管吸光值,，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。如果測(cè)定吸光值過小,，建議增大樣本量后再進(jìn)行測(cè)定,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.752-0.012=0.74,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.672-0.014=0.66,。按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=208.76×ΔA ÷ΔA標(biāo)÷W =2340μg/g 質(zhì)量。

2,、 取100μL牛血清加入1mL提取液一,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清，之后按照測(cè)定步驟操作,，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.061-0.016=0.045,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.672-0.014=0.66。按照液體體積計(jì)算含量得：肌酸含量（μg/mL）=2296.39×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=156.57 μg/mL血清,。

肌酸含量檢測(cè)試劑盒（酶法）  氮代謝 肌酸含量檢測(cè)試劑盒（酶法）  氮代謝