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肌酸含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC4920

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

標(biāo)準品：1 mg一水肌酸,。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解,，即1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準儲備液,。用不完的試劑4℃保存一個月。

產(chǎn)品說明：

肌酸(Creatine)是一種含氮化合物,，自然存在于脊椎動物體內(nèi),，能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細胞提供能量。肌酸可由精*酸（arginine),、甘*酸（glycine）及甲*氨酸（methionine）三種氨基酸合成,，可由人體自行合成,，也可以從食物中攝取。大約95%的肌酸存在于骨骼肌中,，主要存在形式為磷酸肌酸,。肌酸作為一種補充劑主要通過增加肌肉質(zhì)量，增強運動表現(xiàn)能力,。肌酸也被作為神經(jīng)肌肉疾病的一種治療藥被廣泛研究,，它可能有助于保護神經(jīng)和改善細胞生物功能狀態(tài)。

肌酸可在堿性條件下與聯(lián)乙酰-α-萘酚發(fā)生反應(yīng),，生成紅色產(chǎn)物在530 nm處有吸收峰,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、低溫離心機、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1,、細菌,、細胞樣本的制備：按照細胞數(shù)量（10⁴個）: 提取液一體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬細胞加入1 mL提取液一）加入提取液一，冰浴超聲波破碎細胞（功率300W,，超聲3秒,，間隔9秒，總時間5 min）,；于4℃,，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二,，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測,。

2,、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液一體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一,，冰浴勻漿后于4℃,，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二,，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測。

3,、血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一,，4℃，12000 g離心10 min,，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測,。

二、測定步驟

1,、 分光光度計預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長至530 nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 標(biāo)準溶液配制：將1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準儲備液，用蒸餾水稀釋至100,、80,、50、25,、12.5,、6.25 μg/mL標(biāo)準溶液待用。

3,、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次,。

三、肌酸含量計算

1,、 標(biāo)準曲線繪制：以一水肌酸標(biāo)準溶液濃度為橫坐標(biāo)（x,，μg/mL），以ΔA標(biāo)準為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準曲線,，得到線性回歸方程y=kx+b,，將ΔA測定帶入方程求得x（μg/mL）,。

2、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

肌酸含量（μg/mg prot）= x×V樣÷（V樣×Cpr）×0.879=x÷Cpr×0.879

（2）按照樣本質(zhì)量計算

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）= x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×0.879=1.044×x÷W

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算

肌酸含量（μg/10⁴ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（細胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）×0.879

= 1.044×x÷細胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

肌酸含量（μg/mL）= x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]×0.879=11.482×x

V樣：加入樣本體積,，100 μL=0.1 mL,；V上清：提取液一提取時上清液體積，0.8 mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；細胞或細菌數(shù)量：以10⁴計；V提取液一：加入提取液一體積,，1 mL,；V提取液二：加入提取液二體積，0.15 mL,；V液體：液體樣本體積,，0.1 mL；0.879：換算系數(shù),，一水肌酸相對分子質(zhì)量149.15,，無水肌酸相對分子質(zhì)量131.13，0.879=131.13÷149.15,。

注意事項：

1,、顯色完成后，請在10 min之內(nèi)完成檢測,。

2,、提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測定,。若想要用蛋白濃度計算肌酸含量需要另取樣本,，即取相同質(zhì)量的組織、同等數(shù)目的細菌或細胞,，用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿,；取相同體積的血清（漿），用1.206mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液）,，用BCA法進行蛋白濃度測定,。

3、如果測定吸光值低于或超過線性范圍吸光值,，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定,。

4、試劑一、試劑二對人體有刺激性,，請采取適當(dāng)?shù)姆雷o措施,。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴乳膠手套操作,。

實驗實例：

取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液一進行勻漿研磨離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=1.335-0.058=1.277,，帶入標(biāo)準曲線y=0.0118x+0.0343，計算x=105.3,。按樣本質(zhì)量計算含量得：

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=1.044×x÷W ×2（稀釋倍數(shù)）=2198.7 μg/g 質(zhì)量,。

取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清,，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.596-0.069=0.527,，帶入標(biāo)準曲線y=0.0118x+0.0343,，計算x=41.754。按照液體體積計算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=11.482×x= 479.4 μg/mL,。

肌酸含量檢測試劑盒 氮代謝 肌酸含量檢測試劑盒 氮代謝