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肌酐（Cr）含量檢測試劑盒說明書（肌氨酸氧化酶法）

可見分光光度法

貨號：BC4910

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每支加入1.7 mL蒸餾水,，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周,。

2. 試劑二：臨用前每支加入1.65 mL蒸餾水,，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周,。

3. 試劑三：臨用前每支加入1 mL蒸餾水（50T/48S）,，充分溶解,。為方便儲存故多給一支。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周,。

4. 試劑三工作液：根據(jù)試驗所需用量,，按照試劑三：蒸餾水=1:9的比例，充分混勻,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

5. 試劑四：臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑-20℃分裝保存兩個月,。

6. 試劑五：臨用前每瓶加入3.4 mL蒸餾水，充分溶解,。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周,。

7. 試劑六：臨用前根據(jù)實驗所需用量，按照試劑六A液：試劑六B液=1:1的比例,，充分混勻,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

8. 標準品：1 mg肌酐,。臨用前加入1 mL蒸餾水,，充分溶解，即1 mg/mL標準儲備液,，2-8℃保存1個月,。臨用前取50μL和200μL蒸餾水混合配制成200μg/mL的標準溶液備用，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說明：

肌酐（creatinine,，Cr），化學式是C₄H₇N₃O,，是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物,，主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性兩種,，外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物,；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。

肌酐在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素,，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化產(chǎn)生過氧化氫,。過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物,，在505nm 有特征吸收峰,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、低溫離心機,、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水、超聲破碎儀,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1,、細菌,、細胞樣本的制備：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300W,，超聲3秒,，間隔9秒，總時間5 min）,；于4℃,，12000g離心10 min，取0.8 mL上清液,，再加入0.15 mL提取液二,，混勻，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測。

2,、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃,，12000 g離心10 min,，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二,，混勻,，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測,。

3,、血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一，4℃,，12000 g離心10 min,，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二,，混勻,，4℃,，12000 g離心10 min后取上清待測。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計預熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長至505 nm，蒸餾水調(diào)零。

2,、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次,。

三,、肌酐含量計算

1、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

肌酐含量（μg/mg prot）= C標×ΔA測÷ΔA標×V樣÷（V樣×Cpr）=200×ΔA測÷ΔA標÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）= C標×ΔA測÷ΔA標×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測÷ΔA標÷W

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算

肌酐含量（μg/10⁴ cell）= C標×ΔA測÷ΔA標×（V上清+V提取液二）÷（細胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測÷ΔA標÷細胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

肌酐含量（μg/mL）= C標×ΔA測÷ΔA標×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]

= 2612.5×ΔA測÷ΔA標

C標：標準管濃度,，200 μg/mL,；V樣：加入樣本體積，60 μL=0.06 mL,；V上清：提取時上清液體積,，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一體積,，1 mL,；V提取液二：加入提取液二體積，0.15 mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；細胞數(shù)量：以10⁴計；V液體：液體樣本體積，0.1 mL,。

注意事項：

1,、提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測定,。若想要用蛋白濃度計算肌酐含量需要另取樣本,，即取相同質(zhì)量的組織、同等數(shù)目的細菌或細胞,，用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿,；取相同體積的血清（漿），用1.206mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當于提取步驟最終樣本上清液）,，用BCA法進行蛋白濃度測定,。

2、如果測定吸光值超過標準管吸光值,，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定,。如果ΔA測定小于0.01，建議增大樣本量后再進行測定,。

實驗實例：

1,、 取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液一進行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測=A測定-A空白=0.159-0.016=0.143，ΔA標=A標準-A空白=0.373-0.016=0.357,。按樣本質(zhì)量計算含量得：肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）=237.5×ΔA測÷ΔA標÷W=951.3 μg/g 質(zhì)量,。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清，之后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測=A測定-A空白=0.095-0.079=0.079,，ΔA標= A標準-A空白=0.373-0.016=0.357,。按照液體體積計算含量得：肌酐含量（μg/mL）= 2612.5×ΔA測÷ΔA標=578 μg/mL血清,。

肌酐含量檢測試劑盒 氮代謝 肌酐含量檢測試劑盒 氮代謝